崔学进, 马世绵, 沈 盼, 时洪伟, 傅仕敏, 贺 俊,邹修平, 周常勇, 王雪峰

(国家柑桔工程技术研究中心，西南大学柑桔研究所，重庆 400712)

柑橘在中国有4 000余年的悠久栽培史,2021年我国柑橘栽培面积289万hm2、产量5 569万t,产量和面积均居世界首位,是我国南方乡村振兴的重要抓手产业。柑橘黄龙病(citrus Huanglongbing, HLB)是由韧皮部杆菌属CandidatusLiberibacter细菌引起的全球性柑橘重大病害,在田间主要由柑橘木虱Diaphorinacitri传播。目前该病在我国部分优势柑橘产区流行风险加剧,非疫区亦面临威胁,使我国由柑橘生产大国向强国转型面临严峻挑战[1]。由于目前尚无有效方法根治黄龙病,生产上采取“三项基本措施”,即使用无病苗木、及时挖除病树和大面积联防联控柑橘木虱防控黄龙病,总体上仍呈“可防可控不可治”的态势。

当前对黄龙病菌致病机制的研究已主要形成以下结论:1)病菌与韧皮部细胞膜互作,在韧皮部细胞间运输聚集,引起胼胝体沉积和筛孔堵塞;此外病菌代谢产物通过改变渗透压来破坏韧皮部功能[2-3]。2)在寄主细胞表面定位的模式识别受体识别黄龙病菌的鞭毛蛋白、脂多糖等病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs),引起耐、感病寄主中胼胝体聚集、活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生等防御响应[4-5]。3)黄龙病是一种病原触发的免疫病害,侵染后导致活性氧在韧皮部组织积累,可通过抗氧化剂或赤霉素减轻黄龙病危害[6]。4)病菌通过分泌系统分泌效应蛋白或其他毒力因子影响寄主靶标的功能,诱导寄主产生病症[7]。本文重点就柑橘黄龙病菌分泌系统特征、效应蛋白与寄主互作机制及抗病种质创制等方面进行综述。

1 韧皮部杆菌属细菌及其分泌系统特征

韧皮部杆菌属的确立与柑橘黄龙病的病原命名相关。韧皮部杆菌属的大部分成员未实现离体培养,但通过田间症状观察、嫁接诊断、病原电子显微镜观察、分子生物学等方法,证明了韧皮部杆菌是柑橘黄龙病、马铃薯斑马病及其他一些作物病害的病原。根据16S rRNA序列差异和病原所分布的地区,黄龙病菌可分为3个亚种:亚洲种“CandidatusLiberibacter asiaticus”(CLas)、非洲种“Ca.Liberibacter africanus”(CLaf)及美洲种 “Ca.Liberibacter americanus”(CLam)[8]。其中亚洲种分布最广,危害最严重,是我国发生的黄龙病病原。韧皮部杆菌属细菌基因组高度简化,缺少核心代谢途径,需依赖寄主植物提供营养,这可能是体外纯培养至今未能取得突破的主要原因[9]。韧皮部是许多胞内寄生菌的天然庇护所,寄生菌寄居于此能够躲避天敌、环境胁迫和农药等的侵袭,同时又能从中吸取糖类、微量元素等营养物质。由于韧皮部的天然屏障和韧皮部寄生菌的独特习性,多数韧皮部寄生菌需靠昆虫介体传播。细菌可依赖韧皮部进行长距离扩散[10]。研究表明,黄龙病菌可借助汁液流动或通过菌毛滑行,在韧皮部中以约3 cm/d的速度迁移,仅为韧皮部营养物质转运速率的0.25%,并能向上和向下运输到成熟叶片和根中[3,11]。柑橘黄龙病菌至今无法离体培养,难以进行传统的分子和遗传操作,极大制约了对黄龙病菌毒力机制的认知。

细菌能利用分泌系统将胞内合成的毒蛋白转运、分泌至胞外,从而调控寄主靶标,抑制寄主免疫反应,完成入侵增殖。目前细菌中发现至少9种分泌系统(T1SS～T9SS),按作用机制的不同,又分为一步法分泌系统(T1SS、T3SS、T4SS、T6SS和T7SS)和两步法分泌系统(T2SS、T5SS、T8SS和T9SS)[12-14]。一步法分泌系统能直接将底物转运到胞外,两步法分泌系统则先依赖内膜跨越转运体,通过一般分泌途径(general secretion pathway, Sec)或双精氨酸转运途径(twin-arginine translocation pathway,Tat)将底物转运至细胞周质,再通过相应分泌系统运送到胞外环境[15-16]。Sec途径通常转运未折叠形式的蛋白,而Tat途径转运折叠形式的蛋白,T2SS、T5SS、T8SS是Sec依赖的分泌路径[16]。

效应蛋白又称效应子、分泌蛋白等,是一类在病原细胞内合成,分泌到胞外,继而进入寄主体内发生效应的蛋白,是病原发挥毒力的重要因子。黄龙病菌为柑橘韧皮部胞内寄生菌,可能也具有将效应蛋白分泌到寄主细胞内干扰寄主防御的功能。Duan等[17]从单头带病柑橘木虱中,利用宏基因组测序首次获得了高度精简、大小为1.23 Mb的黄龙病菌完整基因组序列,全基因组分析发现,黄龙病菌中虽没有革兰氏阴性细菌常见的T3SS和T4SS,但有T1SS和Sec分泌途径。

T1SS分泌系统分泌过程中不需要信号肽的剪切,分泌的蛋白又称为非经典分泌蛋白。有关黄龙病菌非经典分泌蛋白的报道较少,Cong等[18]发现在T1SS基因簇旁边存在一个金属蛋白酶(Serralysin蛋白)基因,该蛋白广泛存在于细菌中且往往由T1SS分泌系统分泌,可以通过降解寄主免疫相关蛋白抑制寄主免疫,因此,推测该蛋白可能是黄龙病菌的毒力因子。

Sec分泌途径可以转运毒力因子、侵袭素和蛋白酶等。典型的Sec识别信号序列是长约18～30个氨基酸的信号肽[17]。韧皮部寄生的植原体主要通过Sec途径完成SAP54、SAP11和Tengu等重要毒力因子的分泌[19-21]。运用生物信息学软件,如SignalP、Phobius等可对Sec分泌蛋白进行预测,为进一步筛选鉴定黄龙病菌效应蛋白奠定基础。Prasad等[22]对柑橘黄龙病菌基因组进行生物信息学分析,预测到166个蛋白具有信号肽序列,进一步通过碱性磷酸酶(PhoA)试验确认了其中的86个蛋白具有胞外分泌能力,推测这些分泌蛋白可能在黄龙病菌和寄主互作过程中发挥作用。

2 柑橘黄龙病菌效应蛋白与寄主互作机制

2.1 黄龙病菌效应蛋白对寄主细胞坏死的影响

对黄龙病菌效应蛋白诱导/抑制细胞坏死功能分析表明,多数效应蛋白具有抑制坏死功能,只有少数几个效应蛋白能触发细胞坏死。Pitino等[23]发现效应蛋白SDE1(CLIBASIA_05315)能诱导本氏烟Nicotianabenthamiana细胞坏死和胼胝质沉积。Liu等[24]报道了一个温度依赖型效应蛋白m460(CLIBASIA_00460),常温(25℃)时,m460定位于细胞核和细胞质,瞬时表达m460只引起本氏烟叶片出现微小坏死斑,高温(32℃)减少m460在细胞核中的积累,而在m460的N端加入SV40核定位序列后可促进m460入核并引起本氏烟叶片严重褪绿和坏死;Oh等[25]发现m460还会抑制丁香假单胞菌Pseudomonassyringaepv.tomato(Pst)免疫激发子PrfD1416V触发的过敏性坏死反应(hypersensitive response, HR)。Li等[26]证实本氏烟中瞬时过表达m03915(CLIBASIA_03915)和m04250(CLIBASIA_04250)可引起衰老叶片韧皮部坏死。Du等[27]发现黄龙病菌原噬菌体区域一个可引起本氏烟过敏性坏死作用的效应子AGH17470,其通过上调病程相关基因(pathogenesis-related genes,PR)和水杨酸(salicylic acid,SA)信号通路基因的表达来激活植物免疫,在柑橘上瞬时过表达AGH17470提高了其对柑橘溃疡病菌Xanthomonascitrisubsp.citri(Xcc)的抗性。

Zhang等[28-29]于2019和2020年先后发现m3875(CLIBASIA_03875)和m4405(CLIBASIA_04405)能抑制小鼠凋亡蛋白(pro-apoptotic mouse protein)Bax和马铃薯晚疫病菌激发素INF1(PhytophthorainfestansINF1)引起的本氏烟过敏性细胞坏死。Pang等[30]发现效应蛋白SDE15(CLIBASIA_04025)能同时抑制柑橘溃疡病菌Xanthomonascitrissp.citri(Xcc)和辣椒疮痂病菌X.vesicatoria效应蛋白AvrBsT诱导的HR反应,表明其是一个广谱免疫抑制子。Du等[31]通过非经典分泌蛋白预测软件SecretomeP鉴定到27个非经典分泌蛋白,其中10个可抑制Bax和INF1引起的细胞坏死和H2O2积累,它们可以通过协同诱导PR基因的表达,抑制寄主早期免疫反应并促进病原菌定殖。Shen等[32]从黄龙病菌中鉴定到一个能抑制免疫激发子Bax和INF1诱导的过敏性坏死、活性氧暴发和胼胝质沉积的效应蛋白SECP8(CLIBASIA_05330),转mSECP8基因能促进黄龙病菌在柑橘中的早期定殖、叶片斑驳黄化和植株矮化。

2.2 黄龙病菌效应蛋白与寄主因子互作抑制免疫反应

Clark等[33]发现SDE1(CLIBASIA_05315)与柑橘木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶(citrus papain-like cysteine proteases, PLCPs)互作,且SDE1通过干扰PLCPs活性抑制寄主免疫。进一步发现,将SDE1在拟南芥中超量表达后,叶片出现类似柑橘感染黄龙病的严重黄化症状;与野生型柑橘相比,转SDE1基因柑橘更易感黄龙病菌,衰老相关基因SAGs(senescence-associated genes)在转基因株系中上调表达,推测SDE1可能与促早熟和衰老相关[34]。Zhou等[35]验证到SDE1与本氏烟DDX3(DEAD-box ATP-dependent RNA helicase 3)蛋白互作,瞬时过表达SDE1和瞬时沉默NbDDX3均能引起本氏烟叶片褪绿,且SDE1能降低NbDDX3转录水平,表明SDE1引起的褪绿症状与NbDDX3下调表达有关。

转SDE15基因葡萄柚Citrusparadisi在接种Xcc Aw菌株后PTI (pattern-triggered immunity)标记基因和PR基因下调表达,且SDE15通过与柑橘感病因子CsACD2(accelerated cell death 2)互作发挥免疫抑制子功能[30]。Li等[36]发现效应因子CLIBASIA_00255编码水杨酸羟化酶(SahA),能够通过降解水杨酸抑制植物防御,纯化的SahA蛋白可降解SA及其衍生物,在转基因烟草中过表达SahA可以消除SA积累和寄主的过敏性坏死反应。

当植物遭遇生物和非生物(干旱、盐碱、涝害、冷害等)胁迫时,细胞内ROS的产生和清除机制无法平衡,导致活性氧的过度积累,进一步造成脂质过氧化、蛋白质变性、碱基突变和DNA链断裂等氧化损伤,甚至造成植株的死亡[37]。因此,及时清除过多的活性氧以维持活性氧稳态,对于植物生理功能的正常运行至关重要。感染黄龙病菌的柑橘叶片ROS水平提高,使用抗氧化剂抑制ROS水平可减轻黄龙病症状[6]。Jain等[38]报道了黄龙病菌UF506株系的SC2原噬菌体上一个非经典分泌蛋白SC2_gp095,该蛋白是一个过氧化物酶,通过下调RbohB的转录来抵御H2O2积累,从而抑制寄主免疫。此外,UF506染色体区域的两个分泌蛋白Lasprx5(CLIBASIA_RS00940)和Lasbcp(CLIBASIA_RS00445)也发挥着过氧化物酶的功能,参与抗活性氧胁迫[39]。Du等[40]发现黄龙病菌原噬菌体区域效应蛋白AGH17488靶向寄主抗坏血酸过氧化物酶6(APX6),促进APX6活性从而抑制ROS积累来提高寄主的感病性。

2.3 黄龙病菌效应蛋白调控寄主细胞自噬

细胞自噬是真核生物内普遍存在的保守的物质降解过程,在植物生长发育、衰老、细胞稳态以及响应生物和非生物胁迫等过程中发挥重要作用[41]。植物细胞自噬的发生过程主要包括:自噬的诱导、自噬体的形成、与液泡的融合。目前已有超过40个自噬相关基因(AuTophaGy-related genes, ATGs)被鉴定,这些基因编码的蛋白在细胞自噬的各个阶段发挥不同作用[42]。在植物与病原互作过程中,植物通过自噬降解限制病原侵染是其重要的防御手段,但病原物也进化出逃逸自噬的机制,调控自噬促进其在寄主内的定殖与增殖[43]。

近年来,植物病原物调控寄主自噬的相关研究取得系列重要进展,但韧皮部寄生菌如何操控寄主细胞自噬的研究甚少。Shi等[44]发现黄龙病菌效应蛋白SDE4405 与柑橘ATG8家族蛋白相互作用,激活本氏烟细胞自噬;通过电镜观察发现,在SDE4405转基因柑橘中,细胞自噬也显著增强;ATG8s响应SDE4405介导的植物免疫抑制,瞬时过表达CsATG8c和SDE4405促进了柑橘溃疡病菌在柑橘叶片的增殖,表明SDE4405诱导的细胞自噬具有促进细菌侵染的功能。Shi等[45]发现黄龙病菌效应蛋白SDE3(CLIBASIA_00420)的表达不仅增强病毒和疫霉侵染烟草和拟南芥的能力,而且显著地增强了柑橘对溃疡病和黄龙病的易感性。进一步研究表明SDE3与柑橘胞质中3-磷酸甘油醛脱氢酶(CsGAPC1/2)互作,CsGAPC1/2可以与柑橘自噬相关蛋白家族CsATG8s (CsATG8A/C/D/F/G/I)直接互作,并特异性地降解CsATG8s;SDE3与CsGAPC1/2的互作进一步增强了CsGAPC1/2对CsATG8s的降解,从而抑制植物的细胞自噬。对该领域的深入研究将进一步阐明黄龙病菌调控自噬的机制并为建立柑橘黄龙病新型防控策略提供理论依据。

3 抗耐病黄龙病种质创制

由于缺乏抗黄龙病的天然柑橘种质资源,利用转基因或基因编辑技术创制抗(耐)黄龙病柑橘种质具有重要的应用前景。将拟南芥抗病基因NPR1(non-expressor of pathogenesis related genes 1)在甜橙Citrussinensis‘Hamlin’和‘Valencia’中分别进行系统超量和韧皮部特异表达,AtNPR1转基因甜橙对黄龙病抗性大幅提高,且病原相关分子模式(PAMPs)、富含亮氨酸受体激酶(leucine-rich receptor kinase,LRR-RKs)等防御相关基因在转基因植物中显著上调表达,此外采用非转基因接穗和转AtNPR1基因砧木组合,可提高植株抗(耐)病性[46-47]。在墨西哥来檬Citrus×aurantifolia中单独或同时表达lysozyme和β-defensin可以显著降低植株中的黄龙病菌的滴度,缓解黄龙病症状[48]。Hao等[49]将柑橘内源Thionins基因在卡里佐枳橙Citrussinensis×P.trifoliata中超量表达,嫁接传菌 1年后,与对照植株相比,转基因植株根和接穗中的病菌浓度显著降低,提高了卡里佐枳橙对黄龙病的抗性。

自2013年CRISPR/Cas9基因编辑技术在植物中成功应用以来,基因编辑技术在柑橘中的研究就受到了广泛的关注。西南大学柑桔研究所团队成功构建了CRISPR/Cas9介导的柑橘基因组编辑技术,并首次成功获得了抗溃疡病的CsLOB1突变体[50]。利用构建的柑橘基因组编辑等技术,团队开展了柑橘黄龙病抗性编辑等分子育种研究,创制了CsPP2B15、CsWRKY22等一批抗病相关突变体和转基因材料[50-53],其中,抗菌肽转基因和CsLOB1突变体抗病材料已获得农业农村部转基因中间试验许可,目前正在开展田间抗性评价。利用转基因技术创制非转基因产品一直是人们关注的焦点问题。CRISPR/Cas9技术诞生后,攻克该技术瓶颈已成为基因组编辑领域和分子育种的热点,并在不同的物种中被成功解决。由于柑橘基因组高度杂合、珠心胚起源、生长周期长、遗传转化效率低,严重阻碍了CRISPR/Cas9技术在创制不含转基因成分的优良突变体中的有效利用[54],已成为柑橘分子育种从研究走向应用的技术瓶颈。最近,美国佛罗里达大学团队利用Cas12a/crRNA编辑系统成功构建了柑橘非转基因基因组编辑技术,获得了抗溃疡病的非转基因突变体[55]。该突变体已获得了美国农业部动植物卫生检疫局(USDA-APHIS)的监管批准和环境保护署(EPA)的豁免监管,大力推动了柑橘基因组编辑育种的商业化进程。

4 展望

近年来在黄龙病菌重要基因功能,特别是效应蛋白的寄主互作因子鉴定与功能研究方面取得了显著进展,为柑橘抗黄龙病定向遗传改良提供了重要靶标。黄龙病菌主要是通过柑橘木虱取食传播到柑橘韧皮部组织,但当前在黄龙病菌-木虱-柑橘三者间互作的研究还有待深入,特别是在韧皮部场景中的相互博弈尚不清晰,如木虱和病菌的效应蛋白如何与柑橘韧皮部组织蛋白相互作用,二者的效应蛋白是否存在协同作用机制?因此深入解析黄龙病菌-木虱-柑橘互作机制,挖掘寄主响应木虱和病菌的关键基因,有望创制抗病种质材料,从根本上解决黄龙病防控难题,保障柑橘产业健康发展。