虞跃跃 俞瑶帅 汪铱宇 孙 欢 孟成鑫 李云霞 朱延继

(1 华北理工大学中医学院,河北,063210; 2 河北中医学院第一附属医院,石家庄,050091)

目前,我国的肿瘤发病率和死亡率均呈现上升趋势,严重影响人们的身体健康和生命质量[1]。而肿瘤相关中性粒细胞(Tumor-associated Neutrophils,TANs)被证实在肿瘤产生和扩散过程当中起到了至关重要的作用[2],其在肿瘤发生发展中的促瘤和抑瘤两面作用,已成为肿瘤学研究领域的热点。此外,中医药在抗肿瘤过程中发挥着重要作用,如中医传统中药的黄芪,其主要活性成分在抗肿瘤方面均起到一定的作用[3]。黄芪发挥抗肿瘤作用的主要活性成分是黄芪多糖(Astragalus Polysaccharide,APS),因而本文通过查阅大量相关文献,总结相关前沿研究,对APS在TANs抗肿瘤方面的积极作用进行展望,以期为进一步的实验研究,明确黄芪在抗肿瘤中的靶点提供理论支持。

1 黄芪多糖的提取、组分成分及药理作用

黄芪即黄耆,始载于《神农本草经》,明·李时珍在《本草纲目·草一·黄耆》云:“耆,长也。黄耆色黄,为补药之长,故名。今俗通作黄芪。”药用部位为多年生草本植物黄芪的根,是重要的补气药。黄芪性温,味甘,以补气升阳、益卫固表、托毒升肌、利水退肿之效治疗脾胃气虚、中气下陷、疮疡溃久不敛、浮肿尿少等症[4],广泛应用于临床。

黄芪干燥根中含有多种活性成分及微量元素,而APS是黄芪发挥药效的主要活性成分之一[5]。APS是一类均一多糖,为淡黄色絮状固体多糖,其中主要成分为杂多糖和葡聚糖,根据其水溶性可分为水溶性葡聚糖和水不溶性葡聚糖,而其中的杂多糖多为水溶性酸性杂多糖,主要包括葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖,其中由半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸组成的糖醛酸含量少,而有些杂多糖仅由葡萄糖和阿拉伯糖2种糖组成[6]。

此前对于APS的提取手法,主要包括热水浸提法、纤维素酶解法及酶解法,其中酶解法对环境要求高,在保证酶不失活的前提下,延长酶解时间提高多糖得率目前尚在进一步的试验中[7]。关于APS的提取方法都存在一定弊端,近年来的超声波辅助提取法[8]、微波辅助提取法[9]等,较好地解决了保留活性成分的问题。但从提取率、提取时间和能源消耗等方面综合考虑,目前APS的提取仍以水提醇沉法和碱醇提取法为主。

目前大多数的研究表明,APS的药理作用包括抗衰老、提高免疫力、改善记忆力、抗骨质疏松及干预2型糖尿病等方面[10]。近年来APS抗恶性肿瘤方面的作用和价值逐渐受到研究者的重视,目前,黄芪中的APS被广泛认为在直接的抗肿瘤活性和免疫应答激活过程中发挥重要作用。研究表明,黄芪多糖抗恶性肿瘤的作用机制可能主要与调节肿瘤免疫、抑制肿瘤细胞增殖,侵袭和转移、诱导肿瘤细胞凋亡及与化疗药配伍的增效减毒等有关[11]。当前对APS的研究多停留在对肿瘤细胞自身的杀伤或抑制以及从各方面提升机体的免疫功能。

就中医正邪相争而言,恶性肿瘤的发生发展属于一个双向的过程,即治疗恶性肿瘤的关键是要恢复机体正常状态下阴阳调和的状态,其中包括“与瘤共生”的正邪动态平衡及恶性肿瘤完全治愈“邪去正安”的状态。具体方法为“损其有余,补其不足”。而APS对TANs在肿瘤发生发展过程中的作用就是一个双向的过程,包括APS对TANs的抗肿瘤作用的促进及促肿瘤作用的抑制。因此就其双向作用展开研究分析,即体现正邪之间的相互关系、相互作用,在宇宙万物间的发生、发展与变化中的意义,为肿瘤的免疫治疗提供了新思路。

2 黄芪多糖及肿瘤相关中性粒细胞的抗肿瘤作用

2.1 肿瘤相关中性粒细胞在肿瘤发生发展过程中的作用 中性粒细胞来源于骨髓,具有分叶形或杆状的核,胞浆内含有大量溶酶体。中性粒细胞内髓过氧化酶、溶菌酶、碱性磷酸酶和酸性水解酶等丰富的酶类均储存在胞浆的溶酶体中,与细胞的吞噬和消化功能有关。作为人体内含量最多的循环白细胞,中性粒细胞具趋化作用、吞噬作用和杀菌作用,在人体抵抗传染的第一道防线中发挥重要作用[12]。

中性粒细胞作为人体最重要的炎性免疫细胞之一,与肿瘤的发生发展密切相关。在肿瘤微环境中,常常聚集有大量中性粒细胞,我们将此类细胞称为TANs。目前,TANs在肿瘤中的作用引起研究者的广泛关注,其对肿瘤的促瘤和抑瘤作用已被越来越多研究者认可[13]。在肿瘤发生发展的早期阶段,TANs主要发挥抗肿瘤作用;而在肿瘤发展至晚期阶段,受肿瘤微环境(Tumor Microenvironment,TME)的影响,TANs释放的细胞因子发生变化,发挥促进肿瘤进展的作用[14]。随着肿瘤发病率的全球性增长,对其深入的研究将有利于攻克这一难治性疾病。

在肿瘤发生时,体内中性粒细胞在趋化因子的作用下被召集至TME内。如图1所示,发生肿瘤的组织内,TANs共有N1和N2 2种类别[14-15]。中性粒细胞在被调集至TME前,主要为发挥抑肿瘤作用的N1表型;在转化生长因子-β(Transforming Growth Factor-β,TGF-β)及其他有关细胞因子的干预下,部分中性粒细胞会被极化,转变为促进肿瘤生长转移的N2表型[16]。为提升中性粒细胞杀伤肿瘤的能力,起到抗肿瘤的能力,N1表型的TANs可以通过下调精氨酸酶(Arginase)、CC趋化因子配体2(CC Chemokine Ligand 2,CCL2)、CC趋化因子配体5(CC Chemokine Ligand 2,CCL5)等的表达,上调肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)、CC趋化因子配体3(CC Chemokine Ligand 2,CCL3)、脂肪酸合酶(Fatty Acid Synthase,FAS)及细胞黏附分子1(Intercellular Cell Adhesion Molecule-1,ICAM-1)的表达来达到此目的。而N2细胞则通过与N1相反的作用机制,削弱中性粒细胞杀伤肿瘤的能力,以促进肿瘤生长及转移[17-18]。

图1 肿瘤组织中中性粒细胞转化与作用机制

2.2 黄芪多糖的抗肿瘤作用

2.2.1 抑制肿瘤细胞增殖 肿瘤细胞作为一种可以无限增殖、异常分化的细胞,增殖是其浸润及发展的基础,抑制肿瘤细胞的无限增殖能力在抗肿瘤治疗中显得尤为重要。而APS对肿瘤细胞的增殖起一定的抑制作用,实验通过不同浓度的APS对食管癌EC109细胞增殖率的影响,证实随着黄芪多糖浓度的逐渐上升,食管癌EC109细胞增殖率远低于对照组。证明APS对抑制肿瘤的增殖起到积极作用[19]。此外,杨琪等[20]研究发现,高浓度的APS对肺癌A549细胞的自噬起积极作用,起作用机制包括上调自噬相关蛋白p62的表达、下调自噬相关蛋白LC3B及Beclin1的表达,从而影响磷脂酰肌醇-3激酶(Phosphatidylinositol-3-kinases,PI3K)/蛋白激酶B(Protein Kinase B,AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian Target of Rapamycin,mTOR)信号通路,抑制了细胞自噬作用。由此推测APS可以通过改善肿瘤微环境从而抑制肿瘤细胞的增殖。

2.2.2 诱导肿瘤细胞凋亡 导致肿瘤发生的核心因素是基因调控的失常,典型表现是肿瘤细胞增殖和死亡速度之比的失衡,其中细胞凋亡的抑制也非常重要。随着对细胞凋亡研究的不断深入,凋亡机制的逐步揭示和凋亡关键分子的发现,“促进肿瘤细胞凋亡”已成为抗肿瘤治疗的重要策略之一。李成军和沈光辉[21]通过研究APS对于结肠癌肝细胞的作用,结果显示,APS可以使线粒体凋亡途径的标志蛋白B细胞淋巴瘤(相关X蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)含量增高、B细胞淋巴瘤蛋白(B Cell Lymphoma-2,Bcl-2)含量下降,二者的比值变小表示细胞色素C可以通过通透性增大的线粒体膜大量进入细胞质内从而激化胱天蛋白酶级联反应,进一步诱导肿瘤细胞的凋亡。除此之外,随着APS浓度的增加,凋亡标志物FAS的浓度也随之增加,同样提示其可激化胱天蛋白酶级联反应,诱导细胞凋亡,表示APS可以抑制结肠癌干细胞的增殖,并依赖浓度诱导癌细胞凋亡。另外,APS联合红外治疗发现,黄芪可增加人鼻咽癌对红外的敏感性,间接增加癌细胞的凋亡数量[22]。

2.2.3 阻滞肿瘤细胞周期 细胞周期通常分为4个阶段,包括G1期、S期、G2期和M期,而调控肿瘤细胞的细胞周期来阻滞肿瘤细胞的增殖以起到抗肿瘤的作用也已成为当下的研究热点。针对APS抗肝癌细胞增殖的实验研究表明[23],APS可通过促进轻链蛋白(Light Chain Protein,LC)3A向LC3B转化以起到上调LC3B蛋白和下调LC3A、p62蛋白表达来阻滞肝癌细胞周期的作用,进而引发线粒体凋亡促进细胞的自噬作用使细胞凋亡,发挥其抗肿瘤作用。在肿瘤发作的过程中,细胞周期中发生的异常调控也有重要作用[24]。对肺癌细胞的细胞周期实验研究表明[25],APS作用于Lewis肺癌细胞(Lewis Lung Cancer Cell,LLC)后,LLC发生了S期阻滞。用黄芪注射液干预鼻咽癌细胞[26],结果显示,黄芪注射液通过将细胞阻滞于G0/G1期,发挥促使细胞凋亡来抑制鼻咽癌细胞增殖的作用。周杰等[27]通过实验研究,给予APS后人胃癌细胞MKN45的增殖得到了抑制,肿瘤细胞停滞于G0/G1期,进一步证实了APS可延缓细胞周期进程。由此推断,APS抗肿瘤作用与阻止肿瘤细胞由G0/G1期进入S期相关。

2.2.4 免疫调节 除了抑制癌细胞增长及抑制癌细胞自噬的作用外,APS还可通过免疫调节发挥其抗肿瘤作用。其免疫调节作用可通过激活免疫效应相关细胞活化和降低有害黏附分子等途径。韩乾杰[28]经过系列研究,发现APS可以调节仔猪肠道微生物平衡,增加肠道内挥发性脂肪酸的含量、增强免疫功能,调节肠道Toll样受体4(Toll-like Receptor 4,TLR4)/核因子κB(Nuclear Factor Kappa-B,NF-κB)信号通路,缓解机体过度免疫应激。APS还可通过增加小鼠脾淋巴细胞和腹膜巨噬细胞的吞噬作用来发挥细胞免疫调节,并对免疫器官作用使受损脏器免受抗癌药造成的更大损害[29]。进一步的实验研究证实[30],APS还能以基因表达调控的形式调节细胞耐药性。免疫力受损的癌症患者更易接受药物刺激,APS可以发挥其减缓西药引起的肝脏损伤等作用。APS还可以平衡细胞促炎/抗炎以实现M1型巨噬细胞极化,进一步抑制肿瘤增长。研究发现,APS可降低巨噬细胞TLR4、髓样分化因子(Myeloid Differentiation Factor88,MyD88)及NF-κB的mRNA相关表达[31],降低促炎症介质IL-1β和TNF-α的分泌、改善小鼠巨噬细胞形态,进而恢复细胞增殖能力以达到抗肿瘤的作用。

2.3 黄芪多糖调节肿瘤相关中性粒细胞的机制

2.3.1 APS促进TANs的抗肿瘤作用 TANs可通过中性粒细胞的细胞毒性作用促进相关肿瘤细胞的凋亡以达到抗肿瘤的作用。其中的细胞毒性因子包括过氧化氢(H2O2)、一氧化氮(NO)、TNF-α等,对肿瘤细胞毒性作用也较强。而黄芪对相关毒性因子的释放起到促进作用。研究表明,黄芪可直接促进NO的生成[32],APS可对H2O2引起的细胞损伤起到保护作用[33]。而APS可抑制正常细胞TNF-α的产生,以达到抗免疫损伤的作用[34]。由此提示,APS可能通过保护正常细胞,以对TANs促进相关肿瘤细胞凋亡作用产生促进作用。

T淋巴细胞是介导抗肿瘤免疫的主要效应细胞,而TANs可以通过调节T细胞间接起到抗肿瘤的作用,γ干扰素的分泌被认为是T细胞发挥免疫功能的重要指标。研究发现,50 μg/mL的黄芪多糖可以诱导大鼠肠黏膜微血管内皮细胞(Rat Intestinal Mucous Microvascular Endothelial Cells,RIMVECs)分泌γ干扰素,证明黄芪多糖在体外可以诱导RIMVECs分泌γ干扰素[35]。而微血管内皮细胞(Microvascular Endothelial Cells,MVECs)被激活后可以作为一种抗原呈递细胞向T细胞呈递抗原以发挥其免疫功能。提示APS可以通过促进γ干扰素的分泌以激活TANs对T细胞的调节作用以促进其抗肿瘤作用。

此外,虽然TANs分为N1与N2两型,但二者在TME中是可以相互转换的,其中IL-12、TNF-α被认为具有诱导N1型的极化作用,以起到抗肿瘤作用。研究发现,APS可以上调荷瘤小鼠IL-12、TNF-α的基因表达量,以诱导TANs向N1型极化以达到其抗肿瘤的目的[36]。另有研究表明,N1分型的TANs通过分泌IL-12、TNF-α等细胞因子,激活CD8+T细胞的细胞毒性作用,进而发挥抗肿瘤作用[37]。由此可见,TANs与T细胞的作用是相互的,而APS作用于二者的交点,即IL-12、TNF-α等细胞因子。以上研究提示,如何通过APS等中医药进一步地增强相关细胞的细胞毒性以有效抑制肿瘤细胞生长以及平衡T细胞与TANs的关系,或将成为未来肿瘤治疗的新思路。

2.3.2 APS抑制TANs的促肿瘤作用 血管的异常增生是肿瘤病发的特征之一,中性粒细胞在其中的作用机制主要体现在其与血管内皮细胞的黏附作用。研究发现,TANs在TME的作用下,可通过增加细胞因子的释放来达到增进血管产生的目的,进而导致患者体内的血管密度与中性粒细胞数量都显著提升[38]。RONCA等[39]提出,体内血管的产生是TANs自行分泌血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)对CXCL1/GROα的一个直接介导作用来诱导完成的。而VEGF可在基质金属蛋白酶9(Matrix Metalloproteinase 9,MMP-9)的释放过程中同步产生,其刺激血管内皮细胞增殖、抑制内皮细胞凋亡作用都是特异性的,是血管产生的关键因子[40],而TANs常被认为是MMP-9的主要来源[41]。因此,TANs产生的VEGF对肿瘤扩散中血管的产生有非常重要的调控作用。黄芪中的相关活性成分则可通过抑制VEGF的表达,发挥本身的抑制肿瘤生长、转移的作用。研究发现,利用APS干预小鼠乳腺癌模型后,可见淋巴细胞的活性明显加强,肿瘤组织内相关热休克蛋白70(Heat Shock Protein 70,HSP70)、VEGF和Bcl-2的表达均有明显降低,提示APS可通过抑制血管增生相关细胞因子的表达起到抑制肿瘤的作用[42]。在黄芪抗胃癌的研究中发现,黄芪能通过抑制人胃癌细胞环氧化酶同工酶2(Cyclooxygenase 2,COX-2)、VEGF和前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)的表达起到抑制胃癌细胞生长的作用[43]。提示黄芪可以通过抑制TANs自行分泌的VEGF的表达,以减少肿瘤组织血管的生成,达到抗肿瘤的作用。

在TANs的促肿瘤机制中,基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinases,MMPs)的主要作用是调控肿瘤血管的生成及转移。MMPs是一种蛋白水解酶,它可以降解细胞外基质内的有效成分来促进肿瘤生长。史琳等[44]发现在胃癌微环境的影响下,中性粒细胞会转化成N2分型,在其增强mRNA的活性并促肿瘤的过程中,MMP-2、MMP-9等蛋白水解酶起到了重要作用。黄芪对MMPs的效用存在调控作用,时晓霞等[45]研究表明对进行了原位瘤手术的裸鼠进行黄芪给药干预,免疫组化及RT-PCR结果显示MMP-2基因表达明显下降。何婷等[46]实验表明黄芪中的活性成分黄芪甲苷在干预了HepG2细胞后其VEGF和MMP-14蛋白水平显著降低,从而抑制了其侵袭、迁移能力。因此,可提示黄芪能够抑制MMPs的表达以达到抑制TANs的相关促肿瘤效果的目的。

TANs对肿瘤的多重影响中,主要的细胞因子为炎症介质和趋化因子。其中中性粒细胞释放的炎症介质包括TNF-α、IL-1、IL-6等,会引起肿瘤细胞的快速增殖[47]。此外,炎症介质IL-6、IL-10还参与了信号转导及转录激活因子3(Signal tTransducer and Activator of Transcription 3,STAT3)信号通路的激活,从而提高肿瘤细胞增殖及转移能力[40]。而APS对相关细胞因子的作用也有重要的调节作用。邱波等[48]研究表明在用APS诱导成熟的DC疫苗治疗荷瘤小鼠之后,其血清内TNF-α、IL-12的含量增加。费煜畅等[49]研究表明APS可以下调IL-10并上调IL-12、TNF-α的基因表达量。提示APS可通过影响细胞因子来调控机体免疫机制从而抑制肿瘤。

3 讨论

综上所述,APS可以同时促进TANs在肿瘤发生发展中的促瘤和抑瘤两方面作用。在促进其抗肿瘤作用方面,APS可以促进相关毒性因子的释放而直接发挥抗肿瘤作用;同时,APS还可以通过促进TANs对T细胞的调节间接发挥抗肿瘤作用。在抑制TANs的促肿瘤作用方面,APS可以通过抑制VEGF、MMPs的表达来减少血管生成及蛋白质的水解来起到抗肿瘤的作用;对相关细胞因子表达的调控也是APS作用于TANs以起到抗肿瘤目的的主要因素。总之,APS调控TANs的作用中可以涉及到抑制血管生成、蛋白质的水解、相关细胞因子的表达、调控细胞周期与细胞凋亡过程等多方面的机制。

传统中医药作为传承千年的瑰宝,在中医整体观和辨证论治思想的指导下,拥有完整的理论体系。且我国的药用资源也极其丰富,经研究发现大量中药具有独特的抗肿瘤作用,其特点包括不良反应小、耐药性低、多成分、多靶点等。但是正由于其多成分、多靶点的特点,使得目前的研究仍不能做到深入、全面地阐述药物的作用机制。辨证论治是中医认识、治疗疾病的基本原则,但由于缺乏系统的评价体系,目前仍需要进行创新、融合[50]。如何在中医学理论指导下积极利用现代科学技术手段发掘中药抗肿瘤潜力,也亟须进一步地探索研究。中西医药物作用疗效的对比及相辅相成关系可能会成为以后的研究方向之一,打破传统医学与现代医学之间的壁垒有利于推进中医药研究的现代化进程。

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