王 洁 侯敏娜 王 梅 梁 晓 杨枫玉

(1 陕西中医药大学附属医院,咸阳,712000; 2 陕西国际商贸学院,咸阳,712046; 3 宝鸡市中医医院,宝鸡,721001)

益母草,为唇形科植物益母草(LeonurusjaponicusHoutt)的新鲜或干燥地上部分,广泛分布于全国各地,具有调经活血,消肿利尿之功,为妇科经产要药[1-3]。现代研究表明,益母草提取物可治疗隐性心肌缺血,降低血胆固醇、三酰甘油水平,降低冠心病的发病率,降低血液黏度和抗血液凝固作用,提高免疫力,抑制前列腺增生等[2-4]。含有生物碱、黄酮、多糖、萜类和挥发油等多种化学成分[3-10],而黄酮等成分均属于酚类物质,具有独特的“天然抗氧因子之美誉”[11-13]。故本实验采用响应法优化超声提取益母草中多酚类工艺,具有以较少的实验次数、在较短时间内能全面优化实验各参数等优势[9-14],并对其DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基、ABTS(2,2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐)自由基体外抗氧化活性的研究,为益母草资源广泛开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药材与试剂 益母草(购于陕西盛兴中药饮片厂,批号:20203203P),经我院生药教研室雷国莲教授鉴定为Leonurusartemisia(Laur.)S.Y.Hu F),没食子酸对照品(中国药品生物制品鉴定所,批号:100091-201609),DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)(上海麦克林生物科技有限公司,批号:S18M11M109858),ABTS(2,2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐)(上海麦克林生物科技有限公司,批号:C10947528),福林酚溶液(南京奥多福尼生物科技有限公司,批号:F8060),无水碳酸钠(天津市河东区红岩试剂厂,批号:20190302)等,所有试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器 数控超声波清洗器(昆山市超声仪器,型号:KH5200DE);高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器,型号:FW100型);电热恒温水浴锅(北京科伟永兴,型号:HH-2);紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器,型号:TU-1810);循环水式多用真空泵[河南省予华,型号:SHZ-D(Ⅲ)],电子分析天平(上海越平科学仪器,型号:AUY220)等。

1.2 方法

1.2.1 药材预处理 将干燥后的益母草置于高速万能粉碎机中粉碎,过60目筛,装入密封性能好的玻璃瓶中,备用。

1.2.2 实验方法 精密称取预处理益母草粉末于锥形瓶中,加入一定浓度的乙醇适量,在超声波功率为100 W,温度40 ℃条件下,超声处理数分钟,过滤,即获得益母草多酚提取液。

1.2.3 标准曲线制备

1.2.3.1 没食子酸标准品的配制 准确称取0.002 5 g没食子酸标准品,置于25 mL容量瓶中,用纯化水溶解并定容至25 mL,摇匀,即得浓度为0.1 mg/mL没食子酸标准品溶液。

1.2.3.2 没食子酸最大吸收波长的确定 精密移取0.1 mg/mL没食子酸标准品溶液1 mL,置于10 mL容量瓶中,加入1 mL福林酚试剂和2 mL、15%碳酸钠溶液,用纯化水定容至10 mL,50 ℃恒温水浴保温30 min后,在波长范围为200～800 nm内测定全波长,实验结果为最大吸收波长在760 nm处。

1.2.3.3 多酚标准曲线的绘制 精密移取0.1 mg/mL没食子酸标准溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL,于10 mL容量瓶中,各加1 mL福林酚试剂和2 mL、15%碳酸钠溶液,用纯化水定容至刻度线,调节温度为50 ℃的恒温水浴锅并恒温保温30 min,并按上述同样实验方法配置空白对照组,在760 nm处测定吸光度,以浓度C为横坐标(x),吸光度A为纵坐标(y),绘制标准曲线。即y=12.517x+0.1287,R2=0.993 2。

图1 标准曲线

1.2.4 多酚得率计算方法 由实验所得的多酚标准曲方程式、公式(1)计算益母草多酚提取率Y(mg/g):

Y=C×V×D/M(1)

式中:C为多酚浓度(mg/mL);D为稀释倍数;V为提取液体积/mL;M为益母草的质量(g)。

1.2.5 单因素考察 准确称取粉碎后的益母草5份、各5 g,置于250 mL锥形瓶中,在超声波功率为100 W,温度40 ℃条件下,考察乙醇浓度(20%、40%、60%、80%、100%)、料液比(30 mL、40 mL、50 mL、60 mL、70 mL)和超声时间(0 min、15 min、20 min、25 min、30 min)3个因素对益母草多酚得率的影响,以获取最佳考察中心点。

1.2.6 响应面试验设计 以益母草多酚得率为评价指标,设计响应面试验,以获得最佳提取方案。基于单因素实验的数据分析上,结合Box-Behnken的设计理念,以乙醇浓度、料液比、超声时间3个单因素作为自变量,以益母草多酚得率为响应值,设计三因素三水平的17组响应面实验方案。见表1。

表1 因素水平表

1.2.7 数据处理 采用Design-Expert 8.0.6软件分析、整理数据。

1.2.8 抗氧化性试验

1.2.8.1 益母草多酚对DPPH清除能力 分别配置浓度为4、6、8、10、12、14 mg/mL的益母草多酚溶液和维生素C对照溶液,移取DPPH母液2 mL和上述溶液2 mL,摇匀,暗处反应1 h,在517 nm处测定吸光度,计算DPPH清除率[11-13]。

DPPH清除率=1-(A1-A2)/A0×100%

式中:A0为2 mL DHHP溶液+2 mL最佳乙醇浓度的吸光度;A1为2 mL DPPH溶液+2 mL待测液的吸光度;A2为2 mL无水乙醇+2 mL待测液的吸光度。

1.2.8.2 益母草多酚对ABTS清除能力的测定 按照文献[13,15],按照1.2.8.1项下溶液制备方法,在734 nm波长处测定吸光度。按上式计算清除率。

2 结果

2.1 单因素实验

2.1.1 乙醇浓度对多酚得率的影响 由图2可知,当乙醇浓度为20%～40%时,随着乙醇浓度增大,益母草总多酚得率也逐渐增加,并达到巅峰值;但是当乙醇浓度大于40%以后,随着乙醇浓度的持续增加,多酚得率开始出现了降低的趋势。益母草多酚的得率在40%时到达最大值。

图2 乙醇浓度对多酚得率的影响

2.1.2 料液比对益母草多酚得率的影响 由图3可知,料液比在1∶6～1∶8(g/mL)时,随着料液比的增加益母草总多酚的得率持续上升,但在料液比为1∶8～1∶10(g/mL)时,益母草多酚的含量开始减少,直到料液比在1∶10～1∶14(g/mL)时益母草多酚得率逐渐趋于平稳,益母草多酚得率在料液比为1∶8(g/mL)时达到最高值。

图3 料液比对多酚得率的影响

2.1.3 超声时间对益母草多酚得率的影响 由图4可知,超声时间在10～15 min范围内时,随着超声时间的增加,益母草多酚的得率呈现上升趋势,并在超声时间15 min时达到巅峰值;超声时间在15～30 min范围内时,增加超声时间并没有持续增加益母草多酚得率,却使得益母草多酚得率呈现下降趋向,益母草多酚得率在超声时间15 min时达到最大值。

图4 超声时间对多酚得率的影响

2.2 响应面优化

2.2.1 响应面设计与结果 通过Design-Expert8.0.6软件对实验所得数据进行多元回归拟合分析,可以得到益母草多酚得率(Y)对乙醇浓度(A),料液比(B),超声时间(C)的二次多元回归方程是:

Y=+3.81+0.25A+0.050B+0.029C-0.048AB-0.25AC+0.23BC-1.04A2-0.68B2-0.37C2

见表2。

表2 试验设计及试验结果

2.2.2 响应面图谱分析结果 由图5三维图可以看出,乙醇浓度的坡面比料液比的坡面陡峭,乙醇浓度的二次项对益母草多酚得率有明显的影响,而料液比相对来说影响较小。由等高线图可以确定的最佳参数范围为:乙醇浓度36%～44%,料液比为1∶7～1∶9(g/mL)。在此范围内的益母草多酚得率最大,反之则会降低。

由图6三维图可以看出,超声时间的坡面相比乙醇浓度的坡面平缓,超声时间的二次项对益母草多酚得率的影响小于乙醇浓度。由等高线图可以确定的最佳参数范围为:乙醇浓度36%～44%,超声时间14～16 min。

由图7三维图可以看出,超声时候的坡面相比料液比的坡面较为平缓,料液比的二次项对益母草多酚得率的影响大于超声时间的影响。由等高线图可以确定的最佳参数范围为:料液比1∶7～1∶9,超声时间14～16 min。

经响应面软件求导得出的最佳实验方案是:乙醇浓度为42.31%,料液比为1∶8.07(g/mL),超声时间为15.05 min,理论得率为3.82%。

2.2.3 实验方案验证 经综合考虑,将实验系数修正为乙醇浓度为42%,料液比为1∶8(g/mL),超声时间为15 min。精密称取益母草粉末3份各5 g,于250 mL锥形瓶中,加入42%乙醇溶液40 mL,在温度为40 ℃,功率为100 W,超声处理15 min,过滤,即得益母草总多酚提取溶液。测定各组吸光度值(A)。见表4。响应面软件得出的最佳工艺得率为3.82%,经实验验证后的得率为3.78%,二者数据相差只有0.04%,说明此方法具有可行性,则超声波辅助提取益母草多酚的最佳工艺为:乙醇浓度为42%,料液比为1∶8(g/mL),超声时间为15 min。

表3 方差分析

图5 乙醇浓度和料液比的三维图和等高线图

图6 乙醇浓度和超声时间的三维图和等高线图

图7 料液比和超声时间的三维图和等高线图

表4 最佳验证数据

2.3 抗氧化实验结果 益母草多酚和维生素C对DPPH、ABTS的清除率均随二者在测试浓度(4～14 mg/mL)范围内,呈正相关,且维生素C的清除率始终大于益母草多酚的清除率。图8可知,维生素C和益母草多酚的浓度为14 mg/mL时,二者对DPPH的平均清除率分别是89.34%和75.96%,差异不明显,说明益母草多酚对DPPH自由基有较强的清除作用;由图9可知,维生素C和益母草多酚的浓度为14 mg/mL时,二者对ABTS的平均清除率分别是79.52%和61.81%,差异在高浓度时较为显著,益母草多酚对ABTS自由基有一定的清除作用。

图8 益母草多酚与维生素C对DPPH清除能力

图9 益母草多酚与维生素C对ABTS清除能力

3 讨论

植物多酚具有较强的抗氧化性,广泛应用于食品、药品等众多领域。本在单因素试验考察基础上,利用响应面法优化益母草中多酚提取工艺。实验结果表明,乙醇浓度影响强于料液比和超声时间,且他们的二次项对益母草多酚提取率的影响显著。最佳提取工艺为:乙醇浓度为42%,料液比为1∶8(g/mL),超声时间为15 min,益母草多酚实际得率为3.78%,与理论值相差0.04%,说明该提取工艺可行,可用于益母草中多酚提取。在抗氧化试验中,可知益母草多酚浓度在4～16 mg/mL范围内,对DPPH自由基和ABTS自由基的清除率均随浓度增大呈上升趋势,且均小于维生素C的,说明益母草多酚具有一定的抗氧化性。这与多酚俗称纯天然的抗氧化剂,在植物中广泛存在,种类繁多、结构庞杂,其抗氧化机制可能是通过螯合金属离子、清除自由基及羰基化合物等途径抑制氧化等有关。

综上所述,本试验初步探索了益母草多酚的提取工艺及其抗氧化性,但对于益母草多酚的作用机制和功效仍需进一步研究与探索,对其应用潜力进行充分挖掘,为益母草资源广泛开发、利用提供理论支撑和技术保障。

利益冲突声明:无。