张敬美 薛思明 李伟利 陈 欢 卢令慧 王其艳

(1 北京中医药大学生命科学学院,北京,100029; 2 北京中医药大学证候与方剂基础研究教育部重点实验室,北京,100029; 3 北京中医药大学证候与方剂基础研究北京市重点实验室,北京,100029; 4 北京中医药大学中医学院,北京,100029)

阿霉素(Doxorubicin,DXR)是一种高效的化疗药物,在临床上广泛用于癌症治疗[1-2]。然而其在长期使用过程中会对人体产生严重的不良反应,尤其是心肌损伤[3-6],可导致左心功能不全,甚至心力衰竭。目前右丙亚胺是美国食品药品监督管理局唯一推荐用于减轻阿霉素心肌损伤的药物,虽然被证明有一定的心脏保护作用,但其会加重骨髓抑制,并出现神经毒性、食欲下降、恶心呕吐、静脉炎、腹泻等不良反应[7]。因此,还需要更多的基础和临床研究积极寻找安全且有效的防治阿霉素心肌损伤的药物。

芪参颗粒(Qishen Granules,QSG)是由黄芪、丹参、金银花、玄参、附子、甘草6味药材组成,临床研究表明其可显著提高心力衰竭患者的射血分数和中医证候积分[8],降低患者的N末端B型利钠肽原(N-terminal Pro-B-type Natriuretic Peptide,NT-proBNP)水平[9]。此外,前期本课题组研究表明QSG可显著改善心力衰竭大鼠和小型猪的心功能并减少心肌纤维化[10-11]。但是关于QSG治疗阿霉素心脏毒性的报道尚不多,其机制亦不明确,因此本研究将结合网络药理学和体内体外实验探索并验证QSG减轻阿霉素心脏毒性的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 无特定病原体(Specific Pathogen Free,SPF)级雄性C57BL/6J小鼠,6～8周龄,体质量(20±2)g,购自斯贝福(北京)生物技术有限公司,动物许可证号为SCXK-(京)-2019-0010,饲养于北京中医药大学SPF级动物房内。按照随机数字法分组,动物自由进食饮水,并按照自然昼夜节律光照。本实验获得了北京中医药大学伦理委员会批准(伦理审批号:BUCM-4-2018001201-1014)。

1.1.2 药物 芪参颗粒(由北京中医药大学自主制备加工处理),普伐他汀(上海第一三共制药有限公司,货号:H20060271),阿霉素(GLPbio公司,美国,货号:GC17576)。

1.1.3 试剂与仪器 BCA定量试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司,货号:P1511-1),Cell Counting Kit-8(江苏凯基生物技术股份有限公司,货号:KGA317),CBA Mouse Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit(BD公司,美国,货号:560485),磷酸化蛋白激酶B(Phospho-protein Kinase B,p-AKT)抗体(CST,美国,货号:#13038),磷酸化促分裂原活化的蛋白激酶(Phosphorylated Mitogen Activated-protein Kinase,p-MAPK)抗体(CST,美国,货号:#9211),促分裂原活化的蛋白激酶P38(Mitogen-activated Protein Kinase P38,MAPKP38)抗体(CST,美国,货号:#9212),磷酸化核因子κB P65(Phospho-Nuclear Factor kappa-B P65,p-NF-κB P65)抗体(Abcam,美国,货号:ab28856),甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase,GAPDH)抗体(Abcam,美国,货号:ab181602),Goat anti Rb二抗(Abcam公司,英国,货号:ab6721),PBS缓冲液(Servicebio公司,货号:G4202),多聚甲醛固定液(Servicebio公司,货号:G1101),DMEM培养基(Gibco,美国,货号:C11995500BT),Trypsin-EDTA(Gibco公司,美国,货号:25300-054),双抗-青链霉素混合液(AQ公司,货号:AQ512),RIPA组织细胞裂解液(Biorigin公司,货号:BN25012-A),蛋白酶抑制剂(普利莱,货号:P1265),蛋白磷酸酶酶抑制剂(普利莱,货号:P1260),ECL Plus超敏发光液(Solarbio,货号:PE0010),无蛋白快速封闭液(雅酶,货号:PS105),一抗稀释液(Biorigin,货号:BN21010),大小鼠尾静脉显像仪(南京卡尔文生物科技有限技术公司,型号:KW-XXY),小动物超声影像系统(加拿大VisualSonics公司,美国,型号:Vevo TM2100),离心机(Eppendorf公司,德国,型号:5424R),组织超声破碎仪(Qiagen公司,德国,型号:HildenTissueLyser II),Multiskan全自动酶标仪(Thermo公司,美国,型号:MK3),低温离心机(Eppendorf公司,德国,型号:5424R),凝胶成像仪及图像分析系统(Bio-rad公司,美国,型号:Molecular lmagery ChemiDocTM XRST),流式细胞仪(BD公司,美国,型号:LSRFortessa)。

1.1.4 网络药理学分析数据库及方法 使用中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)[12]数据库根据口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)≥30%和类药性(Drug Likeness,DL)≥0.18对QSG中的活性成分及靶点进行筛选,通过人类基因数据库(The Human Gene Database,GeneCards)(https://www.genecards.org/)[13]、人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM)(https://omim.org/)[14]及遗传药理学与药物基因组学数据库(Pharmacogenetics and Pharmacogenomics Knowledge Base,PharmGKB)(https://www.pharmgkb.org/)[15]等数据库以“Doxorubicin/Adriamycin Myocardial Injury”为关键词对阿霉素心脏损伤疾病靶点进行筛选,而后取QSG和阿霉素心肌损伤的交集靶点输入蛋白互作数据库(Search Tool for the Retrieval of Interaction Gene/Proteins,STRING)(https://cn.string-db.org/)[16]数据库,物种设置为“Homo Sapiens”,获得蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein Interaction,PPI)网络,下载此相互作用网络的TSV格式文件,导入Cytoscape软件进行可视化分析,使用其Cytohubba插件筛选核心靶点,MCODE插件进行交集靶点的聚类分析。将聚类后得到前2个模块的蛋白质靶点导入Hiplot(https://hiplot.com.cn/)数据库,阈值为P<0.01,进行京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析的筛选,选取前10个条目绘制成气泡图。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 本实验选SPF级C57BL/6J雄性健康小鼠30只,入组时体质量(20±2)g,在动物房适应性喂养3 d后,根据随机数字法分为正常组、阿霉素组、芪参颗粒低剂量组、芪参颗粒高剂量组和阳性药物普伐他汀组,每组6只。阿霉素组和给药组(芪参颗粒低剂量组、芪参颗粒高剂量组和阳性药物普伐他汀组)小鼠在实验的第1天和第4天尾静脉注射阿霉素,剂量为6 mg/kg,累计剂量为12 mg/kg;正常组则尾静脉注射等体积的生理盐水。

1.2.2 给药方法 实验开始前5 d,对QSG给药小鼠灌胃给药,根据等效剂量换算芪参颗粒给药剂量,低剂量组为2.5 g/kg,高剂量组为5 g/kg;给予阳性药物组的小鼠灌胃普伐他汀40 mg/kg;同时,给予空白对照组和模型组小鼠等体积的生理盐水灌胃,累计12 d,实验第7天进行超声取材,实验结束。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 心脏超声检测 对各组小鼠进行超声检查以评估心功能。取胸骨旁短轴切面,由超声引导M型曲线进行检测,相关参数包括心脏射血分数(Ejection Fraction,EF)和短轴缩短分数(Fractional Shortening,FS)。

1.2.3.2 病理学检测 心肌组织在4%多聚甲醛中充分固定后,置于包埋框中进行石蜡包埋,切片。经苏木精-伊红(Hematoxylin Eosin,HE)染色后制作病理切片,在超分辨显微成像系统拍摄图像以分析心脏组织局部病理改变。

1.2.3.3 蛋白质印迹法检测相关蛋白表达 将心脏组织在低温条件下充分研磨,蛋白质定量试剂盒(Bicinchoninic Acid Assay,BCA)方法蛋白定量后,用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)(10%)对蛋白样品进行电泳分离并转移至聚偏二氟乙烯膜(Polyvinylidene Fluoride,PVDF)膜上;将膜与一抗在4 ℃下孵育过夜,二抗在室温孵育1.5 h,再用Omni-ECLTM增强型化学发光检测试剂盒(Omni-ECLTMEnhanced Pico Light Chemiluminescence Kit,Omni-ECLTM)在凝胶成像仪中曝光成像。最后,使用Image-Lab软件对条带的灰度进行分析,以统计目的蛋白在不同组中的差异。

1.2.3.4 流式多因子检测技术CBA(Cytometic Bead Array,CBA) 首先使用细胞计数试剂(Cell Counting Kit-8,CCK8)法对QSG的无毒范围和有效范围进行浓度梯度的筛选。而后取对数生长期的H9C2细胞,用含10%胚牛血清的高糖培养基培养24 h后,弃上清液,加入浓度为800 μg/mL QSG预给药24 h。弃上清液,1 μmol/L阿霉素刺激的同时给予800 μg/mL的QSG,24 h后进行收集上清,用于后续细胞因子的检测。具体参照说明书的方法如下,向带有滤膜(0.22 μm)的96孔板中加入Wash Buffer进行润洗,对标准品进行梯度稀释;向孔中分别加入一定体积的Th1/2/17 Capture Beads混合液(40 μL/孔)、标准品或样品(50 μL/孔)和Mouse Th1/2/17 PE Detection Reagent(40 μL/孔),在室温条件下孵育2 h,离心去除多余液体,每孔加入120 μL的Wash Buffer,充分混匀珠子,并将珠子转移至新的U型96孔板内;流式上机检测,用FCAP Array软件分析样品中细胞因子的含量。

1.2.3.5 癌细胞活力测定 使用CCK-8试剂盒评估细胞活性。将MCF-7人乳腺癌细胞接种在96孔板中,每孔设有5 000个细胞,待1 μmol/L阿霉素造模24 h后每孔加入100 μL含10%CCK-8的完全培养液孵育2 h,培养至检测时间点后取出培养板,放置酶标仪中450 nm处测定各组光密度(Optical Density,OD)值。

2 结果

2.1 QSG改善阿霉素诱导的心脏功能障碍 与空白对照组比较,模型组小鼠的EF和FS显著降低(P<0.01)。而在不同剂量的QSG治疗后,小鼠的EF和FS值显著升高(P<0.01)。图1。

图1 QSG改善小鼠阿霉素诱导的心肌损伤的心功能

2.2 QSG缓解阿霉素诱导的心肌组织损伤 空白对照组小鼠心肌细胞排列整齐,形态完整且着色均匀,细胞核无明显结构性改变。模型组心肌细胞排列松散,心肌纤维横纹不清楚甚至消失不见,并伴有明显的炎症细胞浸润,正常结构丧失。经不同剂量QSG治疗后,小鼠心肌细胞排列整齐,且炎症细胞浸润减少,病理变化被显著改善。见图2。

2.3 QSG治疗阿霉素心肌损伤的网络药理学分析 筛选出174种化学成分,261个基因靶点;疾病基因合并去重后获得1 521个基因,二者交集靶点为156个。排名前10的Hub基因分别为:信号转导及转录激活因子3(Signal Transduction and Transcriptional Activator 3,STAT3)、白细胞介素6(Interleukin 6,IL6)、肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF)、白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、蛋白激酶B1(Protein Kinase B1,AKT1)、半胱氨酸蛋白酶3(Apoptosis-Related Cysteine Peptidase,CASP3)、血管内皮生长因子A(VAscular Endothelial Growth Factor A,VEGFA)、TP53、过氧化物合酶2(Peroxidase Synthase 2,PTGS2)、禽肉瘤病毒17的假定转化基因(V-Jun Avian Sarcoma Virus 17 Oncogene Homolog,JUN)(图3A)。模块一包括CASP3、JUN、AKT1等共70个靶标蛋白(图3B),模块二包括小窝蛋白1(Caveolin1,CAV1)、热休克蛋白B1(Heat Shock Protein B1,HSPB1)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein,BAX)等共21个靶标蛋白(图3C)。模块一KEGG共富集到142条通路,结果显示,主要与IL-17信号通路、TNF信号通路、Toll-like Receptor等炎症及癌症信号通路相关;模块二共富集到56条生物条目,结果显示,主要与丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen Activated Protein Kinase,MAPK)、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(Phosphatidylinositol 3 Kinase/protein Kinase B,PI3K/AKT)、p53及癌症信号通路等。

图2 各组小鼠的心脏组织损伤情况(HE染色,×20)

2.4 QSG对PI3K/AKT及MAPK通路相关蛋白表达的影响 结果显示,与空白对照组比较,模型组小鼠心肌细胞磷酸化蛋白激酶B(Phosphorylated-protein Kinase B,p-AKT)的表达量显著下降,磷酸化丝裂原活化蛋白激酶(Phosphorylated Mitogen Activated-protein Kinase,p-MAPK)及磷酸化核因子κB(Phosphorylated Nuclear Factor-κB,p-NF-κB)的表达量显著升高;与模型组比较,QSG观察组小鼠心肌细胞p-AKT表达量显著升高,p-MAPK及p-NFκB的表达量显著降低。见图4。

2.5 QSG对阿霉素诱导的H9C2细胞相关炎症指标的影响 结果显示,与空白组比较,阿霉素显著提高了H9C2细胞中炎症介质γ干扰素(Interferon-γ,IFN-γ)、IL-6、IL-17A和TNF的水平,而QSG可逆转阿霉素诱导的相关炎症介质水平的升高。见图5。

图3 QSG治疗阿霉素心肌损伤的网络药理学分析

图4 QSG对小鼠心脏组织p-AKT、p-MAPK及p-核因子κB蛋白的影响

2.6 QSG不影响阿霉素的抗肿瘤活性 CCK-8结果显示,与单独使用阿霉素比较,联合使用QSG后未减弱阿霉素对肿瘤细胞增殖的抑制作用。见图6。

图5 QSG对阿霉素诱导的H9C2细胞相关炎症指标的影响

图6 QSG对阿霉素抗肿瘤效果的影响

3 讨论

阿霉素是一种广泛使用的化疗药物,可提高癌症患者的生存率,但会诱发不可逆的心肌损伤[17]。多项研究表明,阿霉素诱发的心肌损伤与氧化应激、炎症反应及凋亡的发生密切相关[18-19]。中医理论认为阿霉素诱发心肌损伤的主要病机是心阳受损或心之气阴不足,推动血液无力,气滞血瘀,以气虚气滞夹瘀为主,推荐使用温阳益气类药物进行治疗。QSG作为温阳益气类方剂,由黄芪、丹参、玄参、金银花、甘草、附子等6味中药组成,在多种心力衰竭动物模型中表现出对心功能有显著的改善作用,而且在临床使用的过程中也具有比较显著的治疗效果[8-9]。但是关于QSG治疗阿霉素心肌损伤的报道尚不多,其药效物质及作用机制不清。网络药理学是一门研究疾病机制和药物作用机制的新学科,其主要目标是多层次、多角度、更系统地解释中药复方成分复杂,治疗疾病的活性成分不清晰等问题,被广泛用于探索中药治疗疾病的分子药理学机制的研究[20-21]。故本研究采用网络药理学分析及体内和体外实验验证,初步探析QSG治疗阿霉素心肌损伤的作用机制,以期为QSG的临床应用提供实验基础。我们首先采用体内尾静脉注射阿霉素的方式构建阿霉素心脏损伤模型,通过超声心动图和病理组织染色等对QSG的药效进行了评价。超声结果显示:与阿霉素组比较,经QSG治疗后,小鼠心脏EF值和FS值显著增加,表明QSG给药后可改善阿霉素诱导的心功能障碍。HE是常用的组织学及病理学检测的基本方法,可直观反映小鼠心肌组织形态与结构的改变。结果显示,空白对照组小鼠心肌细胞排列有序,形态完整;在模型组中观察到心肌纤维断裂,心肌细胞排列紊乱及炎症细胞的浸润。与模型组比较,QSG组表现出心肌细胞排列紊乱状态改善,细胞核趋于完整,且炎症细胞浸润明显减少,表明QSG减轻了阿霉素诱导的小鼠心脏的病理改变。

而后我们从PPI网络互作结果发现QSG治疗阿霉素心肌损伤的核心靶点主要STAT3、IL6、TNF、IL1B、AKT1、CASP3、VEGFA、TP53、PTGS2。一些研究表明,心脏STAT3可通过抑制细胞凋亡和自噬来预防阿霉素诱导的心肌病[22-23],此外可参与调控血管稳态的关键生长因子VEGFA的转录和表达,减少阿霉素诱导的心肌损伤[24]。AKT是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,参与细胞存活、增殖和代谢的调节,在阿霉素处理的小鼠心脏中其活性受到抑制[25]。越来越多的研究表明,AKT激活可预防阿霉素引起的心肌细胞凋亡,而抑制AKT的活性则会加重阿霉素诱导的心肌细胞凋亡和心功能障碍[26-27]。IL-6、TNF、IL-1β是炎症介质,据报道,核因子κB可在阿霉素诱导心肌细胞损伤后的1 h内被激活,激活的核因子κB可诱导合成TNF-α、IL-1β及IL-6等炎症介质,这些炎症介质可形成炎症反应微环境并募集白细胞进入心肌,进而加重炎症反应损伤[28-33]。

根据KEGG通路富集分析,QSG治疗阿霉素心肌损伤与IL-17信号通路、TNF信号通路、Toll-like Receptor信号通路、MAPK信号通路、PI3K/AKT信号通路及癌症信号通路等相关,大多数参与炎症反应,提示炎症反应在QSG治疗阿霉素心肌损伤中发挥重要作用。其中MAPK是真核生物中一组高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,由p38-MAPK激酶(p38-MAPKα,β,γ和δ亚型)、c-jun氨基末端激酶(JNK1-3)和胞外信号调节激酶1-2(Extracellular Signal-regulated Kinase1-2,ERK1-2)组成,该通路的功能是调节细胞对有丝分裂和胞外刺激的反应[34]。PI3K/AKT信号通路是细胞内最重要的信号通路之一,在细胞代谢、细胞生长、细胞增殖、细胞凋亡和炎症反应等基本细胞活动中起主要作用[35]。既往的研究发现,MAPK和PI3K/AKT信号通路与自身免疫性疾病[36-37]、炎症疾病[38-39]、心血管疾病[40-41]、癌症[42-43]和神经退行性疾病[44-45]等密切相关,并针对其开发出一系列的药物。在阿霉素诱导的心脏毒性模型中,炎症反应是阿霉素导致心脏毒性的一个重要病理特征,研究者们也对MAPK和PI3K/AKT信号通路进行了一系列研究。据报道,阿霉素激活p38 MAPK,JNK,ERK和NFκB可诱导心脏组织炎症反应[46]。SHI等[47]发现甘草素可以抑制阿霉素诱导的小鼠心脏组织中p65、IκBα和磷酸化的p38 MAPK、JNK和ERK的水平,表明其可以通过抑制MAPK/NFκB途径发挥对阿霉素诱导的心脏毒性的抗炎作用。THANDAVARAYAN等[48]发现五味子苷B以剂量依赖性的方式减弱阿霉素诱导的小鼠心脏p38 MAPK的激活和IL-1β,IL-16和TNF-α等炎症介质的表达,进而发挥抗炎作用。近年来的研究发现阿霉素也通过下调PI3K/AKT生存途径诱导心肌细胞凋亡[49]。YU等[50]发现姜黄素通过PI3K/AKT依赖性方式抑制阿霉素诱导的心肌细胞焦亡,进而改善阿霉素诱导的心肌损伤。同样的,SAHU等[51]发现芹菜素和阿魏酸对阿霉素处理的大鼠心肌细胞表现出浓度依赖性的保护作用,其主要的机制与PI3K/AKT信号通路密切相关。本研究发现QSG可以显著减轻阿霉素诱导的小鼠心脏组织中炎症细胞的浸润,并且其可以抑制阿霉素处理的H9C2中IFN-γ、IL-6、IL-17A和TNF等炎症介质的水平,减轻炎症反应。在QSG的抗炎机制中,我们发现QSG可抑制心脏组织中p-MAPK及p-核因子κB的表达,并促进p-AKT的水平。因此,QSG可以在体内和体外表现出明显的抗炎能力,具体机制可能与核因子κB、MAPK和PI3K/AKT信号通路有关。

为了评价与QSG联用后是否会影响阿霉素本身的抗肿瘤效果,本研究使用人乳腺癌细胞MCF-7进行验证。CCK-8结果表明在与QSG联用后,MCF-7的细胞活力与模型组差异无统计学意义,表明阿霉素与QSG联用后不会影响阿霉素本身的抗肿瘤效果。

4 小结

综上所述,本研究通过网络药理学系统分析了QSG治疗阿霉素心肌损伤的潜在机制,并通过体内及体外实验评价了QSG治疗阿霉素心肌损伤的有效性及安全性,主要表现为减少炎症反应损伤并且不影响阿霉素本身的抗肿瘤效果,从而改善心功能。但本研究只是对QSG抗阿霉素心肌损伤的机制进行了初步探究,后续还需要更多的实验进行验证,比如对动物进行敲减基因的处理,对细胞实验使用干扰小分子或抑制剂来抑制相关蛋白的表达,进一步明确QSG治疗阿霉素心肌损伤的确切机制,从而为阐明QSG的作用机制奠定坚实的基础。

利益冲突声明:无。