郎伍营，张佳怡，赵永平

（1.商洛学院 生物医药与食品工程学院，陕西商洛 726000；2.商洛学院 电子信息与电气工程学院，陕西商洛 726000）

紫苏（Perilla frutescns L.）分布广泛，尤其在中国、日本、韩国等东亚国家[1]，作为一种常用于鱼和螃蟹烹饪的香料，在中国已有2 000多年的解毒历史[2]。紫苏被列入我国首批“药食同源”植物，在日常生活和社会生产等方面应用潜力巨大。紫苏叶在中医治疗感冒、咳嗽、恶心、呕吐、腹痛、便秘、哮喘和食物中毒等方面也有重要作用[3]。近年来，人们对紫苏提取物的抗炎[4]、抗氧化[5]、抗菌[6]等生物功能活性的研究备受关注。多糖是紫苏叶主要的生物活性成分之一，且具有免疫调节、抗病毒及抗癌、降血糖、抗氧化等许多方面的生物活性，但是国内外对紫苏叶多糖提取工艺及其理化特性的研究还有待深入[7]。目前紫苏叶多糖提取的方法有微波提取法、超声波提取法等[8-9]，但超声波辅助提取法的缺点是：对容器的要求较高，要能承受住超声波的震动；产生的噪音很大，且无法避免；一般不需要加热，但由于其本身存在较强的热效应，所以必须对温度进行控制。微波辅助提取法的缺点是：所选用的原料必须具备热稳定性，如果不具备热稳定性，在微波加热过程中生物活性物质容易失活或者变性；原料还要具备良好的吸水性，反之在微波加热过程中不能获得足够的微波来击破自身组织，无法提取到组织内生物活性物质。此外，由于在提取过程中需要用到高温，会使细胞破裂，将一些杂质溶于所提溶剂中，降低提取效率。目前以双酶法提取紫苏叶多糖的工艺未见报道。鉴于此，本研究对紫苏叶采用双酶法提取多糖，通过正交试验法对紫苏叶多糖的提取进行工艺优化，并研究紫苏叶多糖的抗氧化活性，为紫苏叶产品的深加工提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

新鲜紫苏叶来源于陕西金亨祥食品科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 紫苏叶多糖的提取

将紫苏叶放于烘箱中80℃烘至恒重，用中药粉碎机打碎，过80目筛得到紫苏叶粉末。准确称取紫苏叶粉末5.000 g，放入烧杯中，以粉末和液体比1：15加水，然后加入一定量的纤维素酶和果胶酶，在pH 5.0条件下进行酶水解，在50℃的水浴锅中提取120 min，再将水浴锅升温至90℃保持30 min灭酶，冷却后以4 000 r/min离心15 min，取上清液并记录体积，将上清液通过旋转蒸发仪在60℃进行浓缩，浓缩至原溶液体积的1/4时，即可得到浓缩液，再加入4倍体积的无水乙醇，放置于4℃下过夜，然后以4 000 r/min离心30 min，取沉淀，用丙酮和无水乙醇反复将其洗涤多次，真空干燥即可得到紫苏叶粗多糖。

1.2.2 单因素试验

分别设置1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%的纤维素酶添加量；0.1%，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%的果胶酶添加量；60，80，100，120，140 min 的酶解时间；40，45，50，55，60 ℃的酶解温度，进行单因素试验。

1.2.3 紫苏叶多糖含量的测定

根据张学新等[10]的方法稍作修改，得到葡萄糖浓度-吸光度标准曲线y=0.014 6x+0.006 9，R2=0.999 8。紫苏叶多糖提取率的计算公式：

式(1)中，c1为紫苏多糖浓度（μg/mL），V 为 100 mL，m1为测定吸光度时所用粗多糖质量（g），m2为粗多糖总质量（g）。

1.2.4 正交试验设计

以单因素试验结果为依据，影响因素选择纤维素酶添加量、果胶酶添加量、酶解时间和酶解温度，考察指标是紫苏叶多糖提取率，进行L9(34)正交试验，探究各因素对紫苏叶多糖提取率的影响。正交试验因素水平设计表见表1。

表1 正交试验因素水平设计

1.2.5 紫苏叶多糖体外抗氧化活性的测定

1）DPPH清除率的测定

将1.0 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液和3.0 mL待测紫苏叶多糖样品溶液，混合均匀，室温避光静置30 min，在波长517 nm处测定吸光度，每组设置3次重复。抗坏血酸为对照组，计算待测样品对DPPH自由基的清除率：

式(2)中，A0为蒸馏水3.0 mL和DPPH 1.0 mL混合液的吸光度值，A1为DPPH 1.0 mL和样品溶液3.0 mL的吸光度值，A2为无水乙醇1.0 mL和样品溶液3.0 mL的吸光度值。

2）羟基自由基清除率的测定

取浓度相同的FeSO4溶液和水杨酸-乙醇溶液（9 mmol/L）各 0.5 mL，添加到含有 1.0 mL待测紫苏叶多糖溶液的试管中混匀，然后再加入8.8 mmol/L H2O20.5 mL，37 ℃放置 30 min，期间每隔10 min晃动数次，使其反应完全，在波长510 nm处测定吸光度，每组设置3次重复，抗坏血酸为对照组，计算羟基自由基清除率：

式(3)中，A1为二价铁离子、水杨酸-乙醇、过氧化氢和待测紫苏叶多糖混合液的吸光度值，A2为蒸馏水、水杨酸-乙醇、过氧化氢和待测紫苏叶多糖混合液的吸光度值，A3为二价铁离子、水杨酸-乙醇、过氧化氢和蒸馏水混合液的吸光度值。

1.2.6 数据处理

采用GraphPad Prism 8软件绘图，IBM SPSS Statistics 26软件处理数据。

2 结果与分析

2.1 纤维素酶添加量对紫苏叶多糖提取率的影响

当果胶酶添加量为0.5%，酶解时间为120 min，酶解温度为50℃时，研究紫苏叶多糖提取率与纤维素酶添加量之间的关系，结果见图1。由图1可知，紫苏叶多糖的提取率随着纤维素酶添加量的增加呈现先降低后升高再降低的趋势，当纤维素酶添加量为紫苏叶质量的2.5%时，紫苏叶多糖提取率最高。当纤维素酶添加量超过2.5%时，紫苏叶多糖提取率降低，可能是因为过多的酶量使底物被完全反应，多余未参加反应的酶不能再催化底物进行反应。

图1 纤维素酶添加量对紫苏叶多糖提取率的影响

2.2 果胶酶添加量对紫苏叶多糖提取率的影响

当纤维素酶添加量为2.5%，酶解时间为120 min，酶解温度为50℃时，研究紫苏叶多糖提取率和果胶酶添加量之间的关系，结果见图2。由图2可知，紫苏叶多糖提取率随着果胶酶添加量的增加呈现先升高后降低的趋势，当果胶酶添加量为紫苏叶质量的0.5%时，紫苏叶多糖提取率最高。当果胶酶添加量超过0.5%后紫苏叶多糖提取率降低，其原因可能与纤维素酶添加量结果一致。

图2 果胶酶添加量对紫苏叶多糖提取率的影响

2.3 酶解时间对紫苏叶多糖提取率的影响

当纤维素酶添加量为2.5%，果胶酶添加量为0.5%，酶解温度为50℃时，研究紫苏叶多糖提取率与酶解时间之间的关系，结果见图3。由图3可知，当酶解时间为120 min时紫苏叶多糖提取率最高。当提取时间超过120 min后，可能是由于反应时间过长，导致酶失活，不能再催化底物进行反应，降低了紫苏叶多糖提取率。

图3 酶解时间对紫苏叶多糖提取率的影响

2.4 酶解温度对紫苏叶多糖提取率的影响

当纤维素酶添加量为2.5%，果胶酶添加量为0.5%，酶解时间为120 min时，研究紫苏叶多糖提取率和酶解温度之间的关系，结果见图4。由图4可知，紫苏叶多糖提取率在酶解温度为50℃时达到最大值。当温度高于50℃时，紫苏叶多糖提取率逐渐降低，原因可能是温度超过50℃之后，使得部分纤维素酶和果胶酶失去生物活性，不能再与底物进行充分反应。

图4 酶解温度对紫苏叶多糖提取率的影响

2.5 紫苏叶多糖提取的正交试验结果分析

按照表1的正交因素水平设计L9(34)正交试验，紫苏叶多糖提取的正交试验结果见表2，紫苏叶多糖提取的正交结果的极差分析见表3，紫苏叶多糖提取的正交结果的方差分析见表4。

表2 紫苏叶多糖提取的正交试验结果

表3 紫苏叶多糖提取的正交结果的极差分析

表4 紫苏叶多糖提取的正交结果的方差分析

由表3可知，影响紫苏叶多糖提取率的因素从大到小依次为酶解时间（C）、果胶酶添加量（B）、纤维素酶添加量（A）、酶解温度（D）。由表4可知，酶解时间、果胶酶添加量、纤维素酶添加量3个因素对紫苏叶多糖提取率的影响均显著，结合极差分析结果，确定紫苏叶多糖最优提取工艺为A3B3C1D2，即纤维素酶添加量为2.5%、果胶酶添加量为2.5%、酶解时间为60 min、酶解温度为50℃，在此条件下，紫苏叶多糖提取率最大，为3.01%。

2.6 验证性试验

为了验证正交试验结果是否准确和可行，按紫苏叶多糖最佳提取工艺条件进行3次重复试验。3次重复试验所得结果基本一致，结果如表5所示，紫苏叶多糖的平均提取率为3.01%。表明本研究筛选的提取工艺合理可行，稳定性好。

表5 紫苏叶多糖提取的正交结果的验证

2.7 紫苏叶多糖的抗氧化活性

2.7.1 紫苏叶多糖清除DPPH自由基的能力

紫苏叶多糖溶液对DPPH自由基的清除能力，如图5所示。由图5可知，紫苏叶多糖质量浓度为0～0.1 mg/mL时，紫苏叶多糖对DPPH的清除率随着紫苏叶多糖质量浓度的增加而逐渐增大。当紫苏叶多糖质量浓度为0.1 mg/mL时，其自由基清除率为91.7%。当紫苏叶多糖质量浓度高于0.1 mg/mL时，紫苏叶多糖对DPPH自由基清除率趋于稳定。

图5 紫苏叶多糖清除DPPH自由基的能力

2.7.2 紫苏叶多糖清除羟基自由基的能力

紫苏叶多糖溶液对羟基自由基的清除能力如图6所示。由图6可知，当浓度为0.1～0.2 mg/mL时，紫苏叶多糖对羟基自由基的清除能力随着浓度的增加逐渐增强。当超过0.2 mg/mL时，紫苏叶多糖清除羟基自由基的能力逐渐趋于恒定，整体结果表明，紫苏叶多糖溶液对羟基自由基的清除能力高于同质量浓度下抗坏血酸的清除能力。

图6 紫苏叶多糖清除羟基自由基的能力

3 讨论与结论

本研究采用单因素试验和正交试验优化了双酶法提取紫苏叶多糖的工艺条件。在纤维素酶添加量为2.5%、果胶酶添加量为2.5%、酶解时间为60 min、酶解温度为50℃时，紫苏叶多糖提取的工艺条件最优，所得紫苏叶多糖提取率最大，可达到3.01%。紫苏叶多糖提取工艺的研究较多，但提取工艺条件各不相同。李冲伟等[11]采用微波辅助法提取紫苏叶多糖，当料液比为 1：25（g：mL），微波提取功率为480 W、微波辅助提取时间为3 min时，紫苏叶多糖的提取率为9.06%。丁素芸等[7]采用热提法提取紫苏叶多糖，最佳提取工艺条件是料液比为 1：30（g：mL）、提取时间为4 h、醇沉浓度为60%时，紫苏叶多糖得率达到（5.22±0.17）%。梁乐欣等[9]运用超声波协同纤维素酶法提取紫苏叶多糖，当酶解时间为40 min、酶解温度为20.4℃、加酶量为2 000 U/g、超声时间为60 min时，紫苏叶多糖的提取率最高为4.54%。张丽红等[8]采用微波技术辅助提取紫苏叶多糖，当装载量为10 mL、微波时间为30 s、微波功率为800 W时，紫苏叶多糖提取率为3.99%。文献[7-9，11]的研究结果均高于本研究结果，其原因可能与紫苏叶多糖提取方法及紫苏的产地有关，还需深入探讨。

本研究还发现，紫苏叶多糖对DPPH有一定的清除能力，当紫苏叶多糖质量浓度为0.1 mg/mL时，其自由基清除率为91.7%，紫苏叶多糖对羟基自由基的清除能力高于同质量浓度下抗坏血酸清除羟基自由基的能力，表明所提取的紫苏叶多糖具有一定的抗氧化活性。牛新茹等[12]采用水提醇沉法提取紫苏叶多糖，并对所提取的紫苏叶多糖进行抗氧化活性检测，结果显示，当紫苏叶多糖浓度小于1.00 mg/mL时，紫苏叶多糖对DPPH清除能力随着紫苏叶多糖浓度的增加而增加，直到当紫苏叶多糖浓度为0.25 mg/mL时清除率达到84.69%，与抗坏血酸清除能力相当。梁乐欣等[9]采用超声波协同纤维素酶提取紫苏叶多糖，并研究所提紫苏叶多糖的抗氧化活性，当紫苏叶多糖质量浓度为0～0.1 mg/mL时，紫苏叶多糖对DPPH清除能力呈线性增长。当紫苏叶多糖质量浓度为0.1 mg/mL时，其清除率达到94.17%。紫苏叶多糖对羟基自由基的清除能力随着紫苏叶多糖质量浓度的增加而增强，并且当紫苏叶多糖质量浓度大于0.2 mg/mL时，紫苏叶多糖对DPPH和羟基自由基的清除能力都略高于同质量浓度下抗坏血酸的清除能力。文献[12]采用水提醇沉法提取紫苏叶多糖，同质量浓度下紫苏叶多糖的抗氧化活性低于本研究结果，而文献[9]通过超声波协同纤维素酶提取紫苏叶多糖，同质量浓度下紫苏叶多糖的抗氧化活性与本研究结果基本一致。其可能原因是提取工艺中有酶的参与，利用酶的高效选择性，促进紫苏叶中多糖溶液的浸出，获得的多糖产物性质稳定，活性高。