林俊燕，马恩耀，2，周劲松，2，孙心恒，罗丽娟，卢敏茹

（1.广东汉潮中药科技有限公司/广东省传统中药创新中心，广州 510000；2.广州采芝林药业有限公司，广州 510360）

由于毒副作用小，符合回归自然的发展理念，中药材越来越受到人们的欢迎，使得中药材的生产量和消费量不断增加。中医药事业在中国发展迅速，已经形成了基于《中华人民共和国药典》药品标准体系。常用中药材大部分都是通过种植获得。

植物生长调节剂（Plant growth regulator，PGR）是可以显著改变植物生长发育的化学物质［1］，根据不同功效可分为三大类：植物生长抑制剂、植物生长促进剂和植物生长延缓剂。与传统农业技术相比，植物生长调节剂具有高效、低毒的特性，在促产增量、改质抗逆等方面发挥了重要作用［2］。植物生长调节剂已广泛应用于中药材的种植栽培，有研究发现，植物生长调节剂已经在几种根及根茎类药材种植过程中大量使用［3］。植物生长调节剂使用不合理会导致其在中药材中的残留，存在降低中药材活性成分含量和危害食用者健康的风险［4-6］。中国现已制定食品类产品中部分植物生长调节剂的最大残留限量标准（GB 2763—2021）［7］，而中药材中植物生长调节剂的残留限量与检测标准尚不明确，导致中药材种植中植物生长调节剂的使用日渐增多，严重影响了中药材的质量和安全，造成较大隐患。因此，建立相应的检测方法是十分必要的。

植物生长调节剂残留量的检测方法包括传统分析方法（化学法、电位滴定法）和色谱法（气相色谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法等），其中LCMS/MS 以其可检测成分微量、准确的特点，已成为检测农药残留的主要方法［8］。本研究针对实际生产过程中，金银花可能使用过植物生长调节剂进行栽培，产品存在植物生长调节剂残留将影响产品的质量安全，结合实际工作，建立一种快速、简单的LC-MS/MS 方法，用于金银花药材中8 种植物生长调节剂农药的残留量测定，以满足日常检验工作。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与试剂

金银花药材购自药材市场。

Agilent 1290-6470 型液相色谱质谱联用仪；TDL-400R 型离心机；ML203T 型天平；EOAA-VM-B型涡旋仪；数控超声波清洗器。

苯醚甲环唑、多效唑、烯效唑、矮壮素、氯化胆碱、芸苔素内酯、对硝基苯酚钠、脱落酸（纯度大于99.0%），上海安谱实验科技股份有限公司；乙腈（色谱纯），上海星可高纯溶剂有限公司；甲酸（色谱纯），阿拉丁；甲酸铵（色谱纯），天津市科密欧化学试剂有限公司；超纯水。

1.2 供试品溶液制备方法

取样品粉末（过三号筛）1.0 g，精密称定，置于50 mL 离心管中，加入含1%甲酸的乙腈10 mL，涡旋1 min后，超声提取10 min，10 000 r/min下离心5 min，取1 mL 上清液，加水1 mL，混合液经涡旋1 min 后过0.22 μm 微孔滤膜，按仪器工作条件进行测定。

1.3 对照品溶液的配制

1.3.1 对照品储备溶液的制备 分别精密称取8 种植物生长调节剂标准品，置于10 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度为1 mg/mL 的对照品储备溶液，密封储存于-20 ℃冰箱。

1.3.2 混合对照品工作溶液的制备 精密量取苯醚甲环唑、多效唑、烯效唑、矮壮素、氯化胆碱、对硝基苯酚钠对照品储备溶液0.1 mL，芸苔素内酯、脱落酸对照品溶液0.5 mL，置于10 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成苯醚甲环唑、多效唑、烯效唑、矮壮素、氯化胆碱、对硝基苯酚钠浓度为10 μg/mL，芸苔素内酯、脱落酸浓度为50 μg/mL 的混合对照品工作溶液，密封储存于-20 ℃冰箱。

1.3.3 标准工作液的制备 取金银花空白基质药材，按照“1.2”的制备方法处理制成空白基质溶液，使用时用空白基质提取溶液稀释混合对照品溶液配成苯醚甲环唑、多效唑、烯效唑、矮壮素、氯化胆碱、对硝基苯酚钠浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/L，芸苔素内酯、脱落酸浓度为2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/L 的标准工作液。

1.4 色谱与质谱条件

1.4.1 液相色谱测定条件 色谱柱：Phenomenex Kinetex C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；流动相：A 为乙腈；B 为5 mmol/L 甲酸铵含0.1%甲酸水；0～2.5 min，5%A→15%A；2.5～5.0 min，15%A→70%A；5.0～7.0 min，70%A→80%A；7.0～11.0 min，80%A→95%A；11.0～11.5 min，A 为95%；流速为0.30 mL/min；进样量为5.00 μL；柱温为40 ℃。

1.4.2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI），正、负离子检测模式下，使用多反应监测（MRM）模式进行测定。离子源温度为250 ℃；鞘气温度为350 ℃；干燥温度为350 ℃；雾化器压力为60 psi；正离子模式毛细管电压为4 000 V；负离子毛细管电压为3 500 V。

1.5 方法学验证

1.5.1 线性和范围 为减少基质对测定结果的影响，采用金银花空白基质提取液加标的方式制备系列浓度的混合对照品溶液，使标准溶液系列和样品溶液具有同样的离子化条件，从而消除样品基质干扰。将不同浓度的混合对照品溶液，按照“1.4”中的分析条件进行测定，以各植物生长调节剂的浓度（X）为横坐标，定量离子对峰面积（Y）为纵坐标绘制校准曲线。

获得由中国烹饪协会颁发的“2017年度百家中国好食堂”奖项；被洪山区食品药品监督管理局认证为A级餐饮服务食品安全等级……文华学院在保障校园食品安全方面落在实处，科学管理与人性化服务相结合，俘获了广大师生的味蕾，让人赞不绝口。

1.5.2 检测限和定量限 取基质混合对照溶液，稀释后注入仪器进行分析，以信噪比（S/N）为3 时的浓度所对应的含量为检测限（LOD），以信噪比（S/N）为10 时的浓度所对应的含量为定量限（LOQ），确定8种植物生长调节剂的检测限和定量限。

1.5.3 重复性 精密称取同一批金银花药材粉末（过三号筛）6 份（每份1.0 g），分别添加相同浓度的混合对照品溶液，按“1.2”的方法制备后按“1.4”的条件分析，计算6 次结果的RSD。

1.5.4 加样回收率 精密称取金银花空白样品9 份（每份1.0 g），分别添加低、中、高3 个浓度的混合对照品溶液，每种浓度各添加3 份，按“1.2”的方法制备后按“1.4”的条件分析，计算这3 组样品的加样回收率，分析其RSD。

1.5.5 样品测定 利用建立的方法对25 批次金银花药材样品进行检测。

2 结果与分析

2.1 色谱条件与质谱条件的优化

2.1.1 色谱条件的优化 对8 种植物生长调节剂的色谱条件进行选择和优化，结果表明这8 种植物生长调节剂在C18 色谱柱得到很好的保留。以甲醇作为有机相的流动相时，液相系统压力较大，色谱峰型较宽，而采用乙腈作为有机相的流动相时，液相系统压力合适，色谱峰尖锐对称。以乙腈+5 mmol/L 甲酸铵含0.1%甲酸水溶液作为流动相，梯度洗脱分离，可以达到满意的分离效果，8 种植物生长调节剂能与基质杂质实现良好的分离，如图1 所示。

图1 植物生长调节剂10.0 μg/L 混合对照品工作溶液MRM 色谱

2.1.2 质谱条件的优化 根据8 种植物生长调节剂的性质与分子结构，在ESI 源中将一定浓度的混合对照品溶液注入液相色谱串联质谱仪，在得到的碎片离子中选取其中2 对离子作为监测离子对，优化多反应监测（Multiple reaction monitoring，MRM）离子对碰撞能和其他质谱参数（表1）。

表1 多反应离子监测分析参数

2.2 方法学验证

2.2.1 线性和范围 以各植物生长调节剂的浓度（X）为横坐标，定量离子对峰面积（Y）为纵坐标绘制校准曲线，观察其线性回归方程和线性相关系数，结果见表2。由表2 可以看出，各化合物在设计的范围内线性关系良好。

表2 植物生长调节剂各化合物的线性回归方程和范围

2.2.2 检测限和定量限 8 种植物生长调节剂的检测限（LOD）为0.000 9～0.045 6 mg/kg，定量限（LOQ）为0.001 8～0.152 0 mg/kg，具体结果见表3。

表3 各植物生长调节剂的检测限和定量限

2.2.3 重复性 经测定，结果显示6 份同一批金银花药材粉末的RSD为1.08%～8.46%，表明该方法重复性良好。

2.2.4 加样回收率 结果显示，8 种植物生长调节剂的加标回收率在71.45%～120.37%，RSD在2.33%～9.48%。结果表明，本研究建立的8 种植物生长调节剂残留测定法的加样回收率良好，可用于金银花药材中8 种植物生长调节剂的定量分析。

2.3 样品测定

利用建立的方法对25 批次金银花药材样品进行检测，检出情况见表4。由表4 可知，所有批次金银花药材未检出氧化胆碱、芸苔素内脂、对硝基苯酚钠。有13 批次的样品检出有植物生长调节剂残留，占总批数的52%，浓度在3.58～133.59 μg/kg，其中多效唑检出率最高，其次为烯效唑。虽然这次考察的基数较小，但是也可以在一定程度上反映金银花在种植中使用植物生长调节剂的情况，存在植物生长调节剂残留，影响产品的质量安全。结果表明，有必要对已经被登记在中药材种植使用的农药制定相应的残留限量，确保这些药材的质量安全。

表4 金银花药材样品植物生长调节剂的残留量测定结果（单位：μg/kg）

3 讨论

金银花属于藤本植物，它的孕蕾及开花均是通过生殖生长来完成的。土壤环境条件发生改变时，植物的次生代谢过程就会受到促进或抑制。作为金银花的主要有效成分绿原酸，《中华人民共和国药典（2020 年版）》［9］对其含量有规定，绿原酸属于植物的次生代谢产物，其生物合成与积累是金银花植株长期适应外界环境条件的结果。

本研究考察了25 批次的金银花药材样品，有13批次的样品检出植物生长调节剂残留，检出率达52%，其中检出频次较高的是多效唑、烯效唑和矮壮素。

多效唑、烯效唑以及矮壮素都具有抑制植物营养生长的作用，在金银花孕蕾期间，喷施一定浓度的多效唑、烯效唑以及矮壮素能抑制金银花的营养生长，促进金银花的生殖生长。徐迎春等［10］通过研究金银花喷施不同浓度的多效唑，结果发现，多效唑可以抑制花枝的伸长生长，增加其叶面积和产量，同时可以提高金银花中绿原酸的含量。有研究表明，矮壮素、多效唑等植物生长调节剂可以提高金银花的单株产量，且调节剂施用的浓度与施用时间可以改善金银花的品质［11］。

本方法样品经1%甲酸乙腈提取后，采用高效液相色谱-串联质谱进行分离和测定植物生长调节剂。方法学考察及样品测定证明，该方法简单、快速、灵敏度高，并具有良好的精密度与准确度，符合农药残留分析的要求，可用于金银花药材中植物生长调节剂残留的定性和定量分析，为金银花药材中植物生长调节剂限量的设定提供技术支持。