罗丽娟，周劲松，2，马恩耀，2，孙心恒，梁朝鹏，谢珊珊

（1.广东汉潮中药科技有限公司/广东省传统中药创新中心，广州 510000；2.广州采芝林药业有限公司，广州 510360）

枸杞子为茄科植物宁夏枸杞（Lycium barbarumL.）的干燥成熟果实。夏、秋二季果实呈红色时采收，热风烘干，或晾至皮皱后，晒干，除去果梗。枸杞子具有滋补肝肾、益精明目的作用，用于虚劳精亏、腰膝酸痛、眩晕耳鸣、阳萎遗精、内热消渴、血虚萎黄、目昏不明［1-3］。枸杞是中国传统的名贵中药材和农业经济作物，原产地为宁夏，2002 年被列入国家卫生部药食两用物品名单。枸杞具有良好的保健功效，每年的消费群体和消费量较大［4］。枸杞的果期较长，规模化种植使得病虫害的发生较为频繁和严重，为了提高产量，农药的使用不可避免。本研究以枸杞子为对象展开试验，前处理方法为QuECh-ERS 法［5-10］，检测方法选用GC-MS/MS 与UPLC-MS/MS，对枸杞子中33 种禁用农药残留进行检测。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

气相色谱-三重四级杆质谱联用仪（8890-7000D，美国Agilent 公司），超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪（1290-6470，美国Agilent 公司），摇摆式高速粉碎机（DFY-400C，温岭市林大机械有限公司），电子天平（AP225WD，日本岛津公司），全自动氮吹仪（Auto EVA 60，广州市锦泉仪器科技有限公司），多管涡旋混合仪（EOAA-HM-01，广州利辉生物科技有限公司），DB-17MS 气相色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm，美国Agilent公司）。

1.2 试剂

55 种禁用农药混合对照溶液（CDAA-M-490407-TY-1.2 mL，上海安谱实验科技股份有限公司），磷酸三苯酯标准溶液（CDAA-S-412134-JD-1 mL，上海安谱实验科技股份有限公司），提取盐（Q221214，纳谱分析技术有限公司），净化管（Q221230，纳谱分析技术有限公司），乙腈（2022081023，CNW），甲酸（GR，广州化学试剂厂），甲酸铵（GR，天津市科密欧化学试剂有限公司），纯化水。

1.3 样品

20 批枸杞子样品产地见表1。

表1 枸杞子样品相关信息

1.4 方法

1.4.1 样品快速处理方法（QuEChERS） 精密称取样品粉末（过三号筛）3 g 于50 mL 离心管中，加入1%（体积分数，下同）冰乙酸溶液15 mL，涡旋2 min直至均匀，浸泡30 min，再准确加入15 mL 乙腈，以2 500 次/min 速率振荡5 min，在冰浴中冷却10 min，加入一包QuEChERS 净化盐包并立即摇匀，以2 500次/min 速率振荡5 min，以4 500 r/min 速率离心5 min，缓慢倒取上清液15 mL 于QuEChERS 净化盐管中，摇匀，以2 500 次/min 速率振荡5 min，以4 500 r/min 速率离心5 min，精密吸取上清液5 mL，于38 ℃氮吹浓缩至基本干燥的状态，用乙腈溶液稀释至1 mL，加入0.3 mL 内标溶液，混合摇匀，通过0.22 μm 滤膜，取滤液进行测定。

1.4.2 溶液的配制

1）混合对照品储备溶液的制备。精密量取0.25 mL 55 种禁用农药混合对照溶液（20～200 mg/L，介质为丙酮），置10 mL 容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。

2）混合对照品工作溶液的制备。精密量取混合对照品储备溶液2 mL，置10 mL 容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。

3）内标溶液的制备。精密量取磷酸三苯酯标准溶液适量，加乙腈制成浓度为0.1 mg/L 的溶液。

4）空白基质溶液的制备。取空白样品枸杞子药材，同“1.4.1”的制备方法制成空白基质溶液。

5）基质混合对照溶液的制备。分别精密量取空白基质溶液1.0 mL（6 份），置氮吹仪上，40 ℃水浴浓缩至约0.6 mL，分别加入混合对照品工作溶液10、20、50、100、150、200 μL，加乙腈稀释至1 mL，涡旋混匀，即得。

1.4.3 分析条件

1）高效液相色谱-串联质谱法。色谱条件：色谱柱Phenomenex Kinetex C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；0.1%甲酸水溶液（含5 mmol/L 甲酸铵）为流动相A，0.1%甲酸水溶液（含5 mmol/L 甲酸铵）-乙腈溶液（体积比为5∶95）为流动相B；梯度洗脱，0～1 min 70%A；1～12 min 70%A→0%A；12～14 min，0%A；流速0.3 mL/min；柱温40 ℃。

质谱条件：离子源为电喷雾（ESI）；正离子扫描；动态多反应监测；离子源温度250 ℃；干燥气温度350 ℃；雾化器压力310 kPa；毛细管电压4 000 V。

2）气相色谱-串联质谱法。色谱条件：色谱柱Agilent DB-17ms（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气为高纯氦气；升温程序为初始温度60 ℃，保持1 min，以30 ℃/min 升至120 ℃，再以10 ℃/min 的速率升温至160 ℃，再以2 ℃/min 的速率升温至230 ℃，最后以15 ℃/min 的速率升温至300 ℃，保持6 min；进样口模式为恒压模式。

质谱条件：离子源为电子轰击源（EI）；监测模式为多反应监测；进样口温度250 ℃；质谱传输接口温度250 ℃。

2 结果与分析

2.1 方法学验证

2.1.1 线性和范围 选取空白基质枸杞子样品，按基质混合对照溶液制备得到含有6 个浓度点的基质曲线，分别在超高效液相色谱-串联质谱和气相色谱-串联质谱上进行跑样分析，观察其线性回归方程和线性相关系数，结果见表2、表3。由表2、表3可以看出，各化合物在设计的范围内线性关系良好。

表2 超高效液相色谱-串联质谱法的回归方程、相关系数、范围、检测限和定量限

表3 气相色谱-串联质谱法的回归方程、相关系数、范围、检测限和定量限

2.1.2 定量限和检测限 以信噪比为3（S/N=3）确定方法的检测限（LOD），以信噪比为10（S/N=10）确定方法的定量限（LOQ），结果见表2、表3。从表2 和表3 可以看出，UPLC-MS/MS 方法的LOD在0.000 1～0.001 2 mg/kg，LOQ在0.000 1～0.004 0 mg/kg；GCMS/MS 方法的LOD在0.000 1～0.001 3 mg/kg，LOQ在0.000 1～0.004 3 mg/kg，定量限均小于《中华人民共和国药典》标准中的定量限。

2.1.3 准确度和重复性 选取空白基质枸杞子样品，在样品制备过程中同时进行低、中、高3 个不同浓度的样品加标，每个浓度的样品加标各做3 个平行，计算这3 组样品的加标回收率，分析其相对标准偏差RSD。结果表明，GC-MS/MS 各农药化合物加标回收率为65.0%～102.1%，标准偏差RSD为0.2%～11.4%。其中，滴滴涕、硫丹、杀螨醇具有较好的回收率。UPLC-MS/MS 各农药化合物加标回收率为65.8%～112.7%，标准偏差RSD为0.1%～9.3%。其中，克百威、涕灭威、蝇毒磷具有较好的回收率，表明该方法回收率良好，准确度高。

2.2 样品测定

本研究选取了20 批次的枸杞子样品，按上述QuEChERS 进行前处理，用UPLC-MS/MS 和GC-MS/MS 进行农药残留检测，33 种禁用农药中克百威有检出，其余32 种禁用农药均未检出。《中华人民共和国药典》2020 年版规定33 种禁用农药中克百威与3-羟基克百威之和以克百威表示，结果大于0.05 mg/kg的为不合格产品。由表4 可以看出，20 批次的枸杞子样品中有14 批次的样品检出农药残留，其中8 批次为农药残留不合格样品，占比40%，其中克百威最大含量为0.350 mg/kg。

表4 20 批枸杞子中检出的农药残留量

3 讨论

2020 版《中华人民共和国药典》对药材和饮片中的33 种禁用农药残留进行了规定，本试验亦借此契机建立对应的检测方法，灵敏度与准确度均符合农药残留分析要求。在随机检测中，发现部分批次枸杞子有不合格或阳性检出的情况，表明枸杞子在种植过程中存在着农药超标使用的问题以及环境污染严重等现象。应当建立一种灵敏度高、稳定性好、检测限低的方法，对枸杞子中的禁用农药残留含量进行监测，为中药材的质量控制提供支持。