王子焱,范金茹,范建民,周 婕,李 苏

高血压是指以体循环动脉压升高为特征的循环系统疾病。一项对我国31个省、自治区、直辖市的179 873名年龄≥18岁常住居民的调查显示,高血压患病率为27.5%[1],且我国高血压患病率呈上升趋势,预估我国成人高血压患病人数为2.45亿人[2]。高血压是心血管病的独立危险因素[3],能够导致血管和心脏等靶器官损害,使得心血管疾病风险增加[4],造成严重的社会经济负担[5]。因此,控制过高血压、减轻血压靶器官损害以及改善心脑血管疾病预后成为当前高血压防控的重点。目前,高血压的治疗药物主要有钙通道阻滞剂、血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素受体拮抗剂等6类药物[6],在高血压的防控中发挥了重要作用,然而,这些药物也存在一些诸如药物不良反应、使用禁忌证、对特殊类型高血压的血压控制不佳等问题[7]。高血压属于中医学“眩晕”“风眩”范畴。现代研究证实中医药对于治疗高血压具有一定疗效,且能够降低高血压导致的不良心血管事件风险[8-9]。因此,发挥中医药特色对于防控高血压具有重要意义。

王行宽教授为首届全国名中医,学验俱丰,主张“杂病治肝、多脏调燮、综合治理”和“善用经方、不乏验方、用药平和、易于效仿”,临床尤精诊治心脑血管疾病。平肝煎为王行宽教授经验方,由天麻、钩藤、白蒺藜、石决明组成,现代研究表明天麻能够通过直接干预肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)或通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)间接抑制RAAS,调节血管张力,抑制血管炎症物质的释放等途径降血压[10-12];钩藤能够通过改善维生素和氨基酸代谢,扩张血管和组织外源钙离子内流等途径降低血压[13-15];白蒺藜通过抑制心室肌中心肌转化生长因子和结缔组织生长因子的表达及改善肠道菌群等[16-17]途径降低血压;石决明可能通过下调血浆血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、血清醛缩酶(ALD)含量,上调血浆一氧化氮(NO)水平以发挥降压作用[18]。然而,平肝煎组方降压的药效物质基础和作用机制尚不明确。网络药理学可以基于靶分子、生物功能和生物活性化合物生成复杂的相互作用网络,并能从分子水平上系统地阐明中医药的作用机制,符合中医药整体论治策略[19],故本研究基于网络药理学及分子对接策略探讨王行宽教授治疗高血压核心处方机制与通路,以期系统、全面阐释其物质基础和作用机制。

1 资料与方法

1.1 化学成分与靶点的搜集

通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP,http://lsp,nwu.edu.cn/tcmsp.php)、本草组鉴数据库(HERB,http://herb.ac.cn/)搜寻药物成分,设置口服利用度(oral availability,OB)≥30%、类药性(drug likeness,DL)≥0.18,得到有效成分后通过其MOL.ID号搜寻单味药成分作用靶点。同时,运用BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)、pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)数据库获得化合物,通过SMILES(Simplified Molecular Input Line Entry System)导入到结构相似度预测靶点数据库SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch)预测靶点。利用全球蛋白质资源数据库(UniProt,http://www.uniprot.org/)下载化合物Excel数据表格,运用“TRIM”函数优化数据,使用“VLOOKU”函数匹配靶点基因名。并通过查阅文献补充未匹配到的基因名称。最后将通过以上方法得到的化学成分的相关靶点蛋白利用Uniprot(https://www.uniprot.org)数据库进行注释。

1.2 药物-成分-靶点网络分析

准备化合物基因“network”文件和type文件,运用Cytoscape 3.8.2软件,导入相关文件,进行网络拓扑学分析,根据度值(Degree值)调整靶点图形、颜色、透明度和大小,构建“药物-中药成分-靶点”网络图。

1.3 疾病靶点的预测

运用人类基因数据库(GeneCards,https://www.genecards.org/)、在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM,https://www.omim.org/)、药物数据库(DrugBank,https://go.drugbank.com/)平台获取疾病相关靶点,疾病名称取“hypertension”为关键词搜索高血压疾病相关靶点。设置对象为“human”,使用“VLOOKUP”函数匹配靶点基因名,筛选药物和疾病交集基因。

1.4 关键靶点的获取

应用Venny(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)软件获取中药活性化合物作用靶点与高血压相关靶点的交集靶点,作为中药复方治疗高血压的潜在靶点。

1.5 PPI网络构建及网络拓扑分析

通过生物分子功能注释系统数据库(STRING,https://string-db.org/)导入交集基因,设置对象为“homo sapiens”,取最高置信度0.900,隐藏游离基因节点,得到蛋白互作关系。结果导入Cytoscape 3.8.2软件中,选择“network analyzer”,得到网络拓扑学参数。介度中心值(betweenness centrality,BC)最短路径穿过单个节点的次数,紧密中心值(closeness centrality,CC)是节点间沟通的难易程度。把Degree值的二倍中位数以上,BC和CC的中位数上作为衡量标准筛选中药与疾病的核心成分靶点,并制作PPI网络互作图。

1.6 基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析

通过Metascape(http://metascape.org/)平台进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,将所得交集靶点导入基因列表中,设置对象为“human”,选择个性化分析,设置最小重叠(min overlap)为3、P值取0.05、最低浓缩度为1.5,得到结果后,制作GO气泡图和KEGG通路图。运用R软件对靶点进行GO、KEGG富集分析。将关键靶点导入R软件,采用clusterProfiler进行富集分析。GO是注释基因和分析这些基因的生物学过程的主要生物信息学工具。KEGG是用于从高通量实验技术产生的大规模分子数据,可集中了解高级功能和生物系统。为了分析药材的功能,设置P<0.05为差异有统计学意义。

1.7 分子对接

对平肝煎治疗高血压的排名靠前的主要候选化合物与核心靶点进行分子对接验证。蛋白质晶体结构由蛋白质结构数据库(RCSB PDB,https://www.rcsb.org/)获取。对接小分子库由TCMSP数据库(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)通过搜索中药获取并建立。首先,使用AutoDock Tools 1.5.6对蛋白质晶体结构进行去水、加氢操作,并进行受体结构准备工作。使用Open Babel及AutoDock程序对小分子库进行拆分等准备工作。对接使用AutoDock程序进行,最终将结果导入Pymol进行对接结果的可视化分析。

2 结 果

2.1 中药有效成分筛选及基因名的转换

经TCMSP数据库,以OB≥30%及DL≥0.18为标准得到中药成分30个,删除未匹配到靶点的成分后得到26个,查阅文献发现,低于标准值的部分成分药理作用强烈,也纳入结果之中,最后得到钩藤18个、白蒺藜4个,通过HERB数据库得到天麻相关成分4个、石决明相关成分4个,最后共得到相关作用靶点751个,去除重复值后,得到387个药物作用靶点。详见表1。

表1 部分中药成分-靶点

2.2 疾病靶点及其与药物作用靶点交集基因的获取

经GeneCards、OMIM、DurgBank平台获取高血压疾病靶点10 259个,其中最大评分为94.51分,最小评分为0.14分。对所得数据卡两次中位数,最后得到9 095个疾病靶点。中药靶点和疾病靶点取交集,删除重复值,得到交集基因279个。详见图1。

图1 中药-疾病靶点韦恩图

2.3 构建中药成分-靶点网络及关键化合物筛选

将基因数据导入Cytoscape 3.8.2软件,得到中药成分-靶点网络图,共421个节点(nodes)、730条边(edges),根据Degree值得到排名居前3位的化合物为大黄素、槲皮素、山柰酚。详见表2。网络图见图2。

图2 中药有效成分-靶点网络图

表2 Degree值排名居前3位的化合物

2.4 PPI网络制作与核心蛋白的获取

经STRING平台分析隐藏游离节点后得到247个节点、1 110条边,平均节度点为9.28。下载TSV文件导入Cytoscape 3.8.2后经网络拓扑学分析,把Degree值的二倍中位数以上,BC和CC的中位数上靶点作为中药复方的核心作用靶点。居前5位的靶点基因分别为蛋白激酶B1(AKT1)、肿瘤蛋白P53(TP53)、肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素6(IL-6)、Jun原癌基因(JUN)。随着Degree值和连接分数的增高,节点的形状越大,颜色越鲜明、线条越粗,蛋白的地位也就越重要。详见图3。

图3 平肝煎PPI网络图

2.5 GO与KEGG通路富集分析

经Metascape平台分析,GO分析结果获得生物过程(biological processes,BP)4 615条,通过logP值和基因数的百分数比重新对数据进行排名,排名居前为对营养水平的反应、对脂多糖的反应、对细菌来源分子的反应、对药物的反应等。分子功能(molecular function,MF)643条,主要涉及核受体活性、配体激活的转录因子活性、血红素结合、DNA结合转录因子结合、受体配体活性、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合等;细胞成分(cellular components,CC)共118条,主要由膜筏、突触后膜、受体复合体、细胞质核周区域、转录因子复合体等构成。提示中药复方可能通过调控细胞核转录因子、参与脂多糖等反应来干预治疗高血压。详见图4。

图4 GO富集分析

KEGG通路富集分析共得到276条富集结果(见图5),主要涉及通路有糖尿病并发症中的高级糖基化终末产物-受体信号通路(AGE-RAGR)、脂质和动脉粥样硬化信号通路、乙型肝炎信号通路、化学致癌-受体激活信号通路、前列腺癌信号通路等,提示中药复方可能通过上述通路调节干预高血压。

图5 KEGG通路富集分析

2.6 化合物靶点-核心蛋白分子对接验证

分子对接结合热能<-4.18 kJ/mol表示具有结合活性,<-20.92 kJ/mol表示结合活性较好。因此,由AutoDock Tools 1.5.6软件分子对接结果可知:拓扑学参数排名居第1位的中药化合物小分子槲皮素与PPI核心蛋白拓扑学参数居前5位的大分子受体(AKT1、JUN、TP53、TNF、IL-6)均具有良好的结合活性,其中槲皮素与AKT1(-29.87 kJ/mol)、TNF(-29.33 kJ/mol)的结合热能较低,结合活性较好。详见图6、图7。

图6 槲皮素与AKT1分子对接

图7 槲皮素与TNF分子对接

3 讨 论

王行宽教授结合历代医家的认识及现代医学研究进展,将高血压对应“风眩”,认为其病在血脉,病机总署阴虚为本、阳亢为标[20],治以平肝潜阳,临证常用平肝煎加减化裁治疗高血压。平肝煎为王行宽教授经验方,由天麻、钩藤、白蒺藜、石决明组成,本课题组前期研究结果显示,王行宽教授诊疗高血压病的核心药物组合即为平肝煎,方中天麻味甘、性平,《本草从新·卷一草部》载天麻可“治诸风眩掉”,可平抑肝阳、息风止痉,是止眩晕之要药;钩藤味甘、性凉,《本草纲目·草部(三)》载主治“头旋目眩”,既能平肝潜阳,又可兼清肝热,以防肝阳上亢,郁而化火;白蒺藜性微温,味辛、苦,可平抑肝阳,又可解郁活血,使肝得疏泄;石决明为质重之介类,性味咸寒,可重镇肝阳,又可凉肝热、护肝阴。四药同入肝经,共同发挥平肝潜阳之效[21]。

本研究从化合物-靶点网络图分析,平肝煎通过大黄素、槲皮素、山柰酚等26个活性成分作用于高血压相关的279个靶点,说明平肝煎通过多成分、多靶点协同发挥治疗高血压作用。现代研究认为大黄素通过提高超氧化物歧化酶(SOD)活性,降低丙二醛(MDA)含量以其抗氧化应激,以发挥降血压作用[22]。槲皮素及其代谢物能够通过抑制血管平滑肌细胞(VSMC)中的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶活性发挥抗氧化作用[23],减少血管超氧化物并改善内皮功能以降低血压,且一项纳入7项随机对照试验的系统评价和荟萃分析显示,补充槲皮素在降低血压方面具有显著效果[24]。同时山柰酚、槲皮素同属于黄酮类化合物,山柰酚、槲皮素能够通过NO/环磷酸鸟苷(cGMP)通路和抑制氧化应激相关炎症生物标志物如MDA、SOD改善高血压[25]。

通过PPI网络的拓扑学性质筛选出平肝煎防治高血压的5个核心靶点基因,分别为AKT1、TP53、TNF、IL-6、JUN。AKT1是磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路下游的主要靶点,主要参与调节炎症反应,激活 PI3K/AKT信号通路会导致肺血管内壁增厚、肺动脉平滑肌细胞增殖和凋亡[26]。p53是TP53的蛋白产物,p53的表达与细胞凋亡增加有关,miR-31a-5p通过加速动脉平滑肌细胞的增殖和通过靶向TP53抑制细胞凋亡参与高血压的发生发展[27]。TNF、IL-6为人体内重要的炎性因子,TNF-α是由多核巨细胞产生的一种细胞因子,具有广泛的生物活性,不仅具有调节机体免疫功能的作用,还可以介导炎症反应过程[28],其中TNF-α可通过分泌内皮素-1(ET-1)收缩血管,导致血压升高;IL-6是一种炎性细胞因子,现有研究表明抑制IL-6使得蛋白酪氨酸激酶2/信号转导子与激活子3(Janus kinase signal transducers 2 and activator of transcription 3,JAK2/STAT3)信号通路的活性降低,从而减轻AngⅡ诱导的高血压[29];JUN是c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路的典型靶标[30],能够通过影响细胞的增殖与分化以及细胞凋亡引发高血压[31]。GO 富集分析预测出平肝煎可能通过调控细胞核转录因子、参与脂多糖等反应来干预治疗高血压,与以上核心靶点基因引发高血压的机制相符合。

KEGG富集分析预测出平肝煎可能通过糖尿病并发症中的晚期糖基化终末产物(advanced glycosylation end products,AGEs)-糖基化终末产物受体(receptor of AGEs,RAGE)信号通路、脂质和动脉粥样硬化信号通路、乙型肝炎信号通路等调节干预高血压。AGE-RAGR信号通路可通过TNF-α、NF-κB等炎症和氧化应激因子的上调,从而导致炎症、内皮功能障碍和氧化应激,引发血管硬化,最终导致血压升高[32-33]。高血压与动脉粥样硬化关系密切,高血压是动脉粥样硬化性心血管疾病的主要独立危险因素[2]。高血压可能通过诱发内皮功能障碍导致炎症细胞浸润,调节造血功能,激活交感神经系统,导致动脉粥样硬化,使心血管疾病风险增加[34],动脉粥样硬化亦会导致高血压情况加重[35]。

分子对接结果显示,拓扑学参数排名居第1位的槲皮素与PPI核心蛋白拓扑学参数居前5位的大分子受体(AKT1、JUN、TP53、TNF、IL-6)均具有良好的结合活性,其中槲皮素与TNF(-29.33 kJ/mol)、AKT1(-29.87 kJ/mol)的结合热能较低,结合活性较好。研究表明槲皮素能够降低血管紧张素Ⅰ转换酶(ACE)活性、AngⅡ和TNF-α以发挥降压作用,而槲皮素调控AKT1信号通路以发挥降压作用的机制目前尚少有相关文献报道,有待于进一步实验验证。

综上所述,平肝煎可能通过抗炎、抗氧化应激、改善血管内皮功能、调节机体免疫方面发挥平肝潜阳之效,以达到降压效果。本研究运用网络药理学技术,探讨了平肝煎通过多靶点、多通路协同作用于高血压病的网络机制,并通过分子对接技术对相关领域进行验证,发现槲皮素是其发挥降压作用的潜在分子基础,对于后期开展平肝煎治疗高血压病的机制研究以及为临床用药提供了理论基础。