罗艳娜,潘杨钰,杨力强

冠心病(coronary heart disease,CHD)也被称为冠状动脉疾病(coronary artery disease,CAD),是由环境因素、遗传因素以及表观遗传成分相互作用导致的一种多因素疾病。而作为遗传因子的miRNA是一类参与基因表达的微小非编码RNA,可以通过与相应的信使RNA(mRNA)结合并改变相应靶蛋白的表达来调控多种细胞和代谢途径[1],特异性miRNA的异常表达在动脉粥样硬化形成和冠心病进展中起到关键作用。本研究以Web of Science核心合集为数据库,以 2006—2021年为时间跨度,对miRNA与冠心病关系研究的相关文献进行可视化分析,进一步识别热点和趋势,为今后研究和临床诊疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 数据来源

检索Web of Science核心合集(http://webofknowledge.com),检索式:TS =(coronary artery disease OR coronary heart disease OR CHD)AND(miRNA OR microRNA OR microrna),文献类型:论文,索引:SCI-EXPADED,时间跨度:2006年1月—2021年12月,检索及数据下载日期为2022年1月10日。共检索出相关文献1 039篇,均以纯文本格式导出检索结果中的所需信息(包括主题、作者、来源和摘要)和引用。

1.2 分析方法

运用Excel 2019软件统计分析年度所发表的论文量和被引频数;运用CiteSpace 5.8.R3软件、VOSviewer 1.6.17软件分析,并构建国家、发文期刊、关键词的可视化图谱。

2 结 果

2.1 年度发文量和被引频数分析

共收集到1 039篇文献,按照发表时间和被引频数进行统计分析(见图1)。从发文量看,2006年关于miRNA与冠心病的研究开始起步,2009年缓慢增加,表明该研究的关注度越来越高,2009—2015年发文量呈明显上升趋势,2016—2019年发文量呈波浪式上升趋势,其中2019年发文量达到峰值(161篇),2020年和2021年的发文量略有下降,但整体热度仍存在。从被引频数看,从2009年开始基本处于持续上升趋势,其中2021年的被引频数达到峰值(5 398次)。说明近年来miRNA与冠心病的研究受到广泛的关注,研究在逐步深入,文献质量较高,注重研究的创新性。在2006—2021年所发表的文献中,被引频数排名居前10位的文献详见表1,其中被引频数最高的3篇文献分别是“Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease”(被引904次)、“Circulating microRNA:a novel potential biomarker for early diagnosis of acute myocardial infarction in humans”(被引873次)、“The muscle-specific microRNA miR-1 regulates cardiac arrhythmogenic potential by targeting GJA1 and KCNJ2”(被引873次),均发表在2010年以前,这些研究均证实了在冠心病模型中成功提取并检测出部分miRNA,并且指出所检测的miRNA的表达及其生物学作用可能会对冠心病进展造成一定影响,这也为今后miRNA相关研究奠定了基础。

图1 年度发文量和被引频数分布

2.2 发表期刊分析

共有367种期刊发表了关于miRNA与冠心病相关研究的文献,文献发表量排名居前10位的期刊分布见表2。发表论文最多的期刊是PLoSOne,共发表文献51篇,第2名是ScientificReports,发表文献27篇,第3名是MolecularMedicineReports,发表文献24篇。运用CiteSpace 5.8.R3软件构建的期刊可视化突现图见图2,图中Cited Journals代表节点类型,Year代表节点出现年份,Strength代表突显强度,Begin代表突显开始年份,End代表节点结束年份,红条代表突显时间跨度。2015年以前,发表相关文献的主要期刊有4种,分别是PhysiolGenomics、MolCellBiol、MolCell、DevCell、GeneDev;2012—2017年发表文献的期刊种类增多,主要集中在ThrombHaemostasis、Blood、Hypertension、BMCGenomics等。2018—2021年,miRNA得到更为深入的研究,发表文献的期刊主要集中在BiomedResInt、EurRevMedPharmaco、MolMedRep、AmJTranslRes等,显示出miRNA相关研究涉及多个学科、多个研究领域。

表2 文献发文量排名居前10位的期刊分布

图2 期刊可视化突现图

2.3 国家与机构共现分析

共有57个国家参与了相关研究,在Web of Science核心合集数据库中论文总量排名居前10位的国家和机构详见表3、表4。目前,我国是发表文献最多的国家,共发表了593篇文献,第2名是美国,共发表160篇文献,第3名是德国,共发表78篇文献。运用CiteSpace 5.8.R3软件构建国家可视化共现图(见图3),图中圆圈面积标志着国家的文献量,圆圈内部颜色标志着论文平均发表年份。国家之间的连线距离代表着国家之间合作的密切度,其中连线距离越短,合作越密切。在miRNA与冠心病的研究领域中,我国所发表的文献数量明显多于其他国家,与美国的合作最为密切。共有1 435家机构发表该研究领域的文献,排名居前10位的机构共发表了280篇论文,依次分别是南京医科大学(37篇)、中山大学(33篇)、哈尔滨医科大学(31篇)、上海交通大学(30篇)、首都医科大学(29篇)、中南大学(27篇)、哈佛大学(27篇)、中国医学科学院北京协和医学院(22篇)、复旦大学(22篇)、美国加州大学(22篇);其中,有8所机构是来自我国重点高校。运用VOSviewer 1.6.17构建机构可视化密度图(见图4),图中黄色的深度和面积表示该机构所发表的论文被引次数,黄色越深,面积越大,则被引频数越大;其中,南京医科大学、哈尔滨医科大学、上海交通大学、首都医科大学黄色面积大于其他机构,表明这4所机构在该研究领域中具有较高的影响力。

表3 发表论文总量排名居前10位的国家分布

表4 发表论文总量排名居前10位的机构分布

图3 发表论文总量的国家可视化共现图

图4 发表论文总量的机构可视化密度图

2.4 作者分析

从作者合作可视化图谱可以了解到有影响力研究团队的相应信息。在该领域中,共有7 051位作者发表了相关论文,其中论文发表量排名居前5位的作者依次是Zhang Y(29篇)、Wang Y(24篇)、Zhang J(24篇)、Li L(20篇),均来自我国。运用VOSviewer 1.6.17构建作者合作可视化共现图谱(见图5),以北京大学人民医院的Li S F、Chen H、Song J X为中心研究团体,团体内合作密切、构架稳定;此外,以Zhang J为枢纽,沟通多个研究团队,在该研究领域中发挥着重要作用。

图5 作者合作可视化共现图

2.5 关键词分析

关键词能够反映出该研究领域的热点,而关键词的突显可以提示研究前沿。排名居前20位的高频关键词详见表5,排名居前5位的关键词依次是expression(表达,339次)、coronary artery disease(冠状动脉疾病,221次)、microRNA(微小核糖核酸167次)、biomarker(生物标志物,147次)、circulating microRNA(142次),这些关键词的中心性均为0。借助CiteSpace 5.8.R3软件构建关键词相关可视化图谱;根据关键词时间线图(见图6),可以得到5个主要的聚类:endothelial cells(内皮细胞)、circulating microRNA(循环微小核糖核酸)、coronary atherosclerosis(冠状动脉疾病)、target gene(靶基因)、extracellular vesicles(细胞外囊泡),其中,在circulating microRNA聚类中,关键词的时间跨度在2009—2018年,部分关键词圆圈面积较大、圈内颜色较丰富,如:acute myocardial infarction、biomarker、mechanism、cell、risk、network等,表明此聚类中关键词总频数最多,相关论文数量较多,研究热度高,但在2019年以后此聚类再无出现新的关键词。coronary atherosclerosis聚类、extracellular vesicles聚类从出现至今不停出现新关键词,但是关键词圆圈面积小,圈内颜色以红色为主,表明这两个聚类中的关键词频数少,未有明显的研究热度。通过关键词突现图(见图7),可以更加直观地看到2018—2021年该领域的研究主流体现在apoptosis(凋亡)、protect(保护)、growth(增殖)、migration(迁移)、long noncoding RNA(lncRNA)、inhibition(抑制)、oxidative stress(氧化应激)、congenital heart disease(先天性心脏病)、circular RNA(circRNA)。

表5 排名居前20位的高频关键词分布

3 讨 论

结合文献及可视化图谱进行综合分析,该领域的主要研究内容集中于miRNA效应及生物标志、基因表达与疾病风险,目前及今后的研究热点体现在凋亡、保护、增殖、迁移、lncRNA、抑制、氧化应激、先天性心脏病、circRNA方面,其中lncRNA-circRNA-miRNA的多重基因网络是一个涉及范围广泛的新兴热点。单个miRNA可以通过调控多个mRNA来干预细胞周期、衰老及凋亡,影响细胞稳态、血管生成和机体免疫功能,从而参与疾病的发生发展;同时,miRNA的表达也受到多重基因网络的调控。以miRNA生物学作用对冠心病的影响相关阐述如下。

3.1 miRNA调控内皮细胞以及影响血管生成

适当的有氧锻炼可以减低冠心病的发病率和致死率,其机制可能是与内皮功能、脂质、炎症、血栓形成有关。调节miR-20a可以影响峰值运动能力和心肺功能[2],Wang 等[3]运用ApoE/LDLR双基因敲除小鼠建立运动相关冠心病模型,实验证实miRNA-20a的过表达能降低血浆内皮素-1(ET-1)、血栓素A2(TXA2)、同源性磷酸酶-张力蛋白(PTEN)的表达水平,增加内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、前列腺素2(PGI2)和血管内皮生长因子(VEGF)的转录和翻译水平,miRNA-20a特异性结合PTEN的3′UTR,通过磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路介导内皮细胞的存活和增殖。在Tang 等[4]研究中发现冠心病病人的外周血内皮祖细胞中的miRNA-206是通过标靶PI3K调节内皮细胞活性,miRNA-206表达显著升高,而PI3K表达降低;在小鼠缺血性后肢模型中,在敲除冠心病内皮细胞中的miRNA-206能激活PI3K、AKT和eNOS,促进血管生成,对动脉粥样硬化有拮抗作用。miRNA-217通过调控标靶沉默信息调节因子1(SirT1)的表达来降低转录因子Fox01和eNOS在血管生成和细胞老化,加快冠心病进展[5-9]。值得一提的是,在血糖正常情况下,内皮微粒通过miRNA-126递送至受体细胞可以促进血管内皮的修复,对保持内皮完整性和预防冠心病的发展具有重要意义[10]。

3.2 miRNA调节氧化应激

在缺氧缺血状态下,miRNA参与心肌细胞的氧化应激反应,并在调节氧化应激方面具有重要作用。心肌细胞中的miRNA-210是体内最重要的与缺氧相关的miRNA,具有调节线粒体代谢、抑制活性氧(ROS)生成和抑制促凋亡基因的作用,进一步研究证实,miRNA-210过度表达可以减少因缺氧而产生的ROS,抑制氧化应激状态的细胞凋亡和损伤[11-13]。有研究证实,在缺氧诱导下,miRNA-136的扩增能防止血管内皮细胞凋亡[14];Lin等[15]实验表明miRNA-136-3p的过表达可以上调超氧化物歧化酶(SOD)水平、下调丙二醛(MDA)水平,降低血浆肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白I(cTnI)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)以及肿瘤坏死因子-α(TNF-α),从而起到降低冠心病大鼠氧化应激和炎症反应,改善病理性损伤,增强心脏功能的作用。

3.3 miRNA抑制血管慢性炎症

血管慢性炎症是导致动脉粥样硬化的重要原因。Zhu 等[16]实验证实,在冠心病病人体内miRNA-155明显高表达,miRNA-155的负反馈调节可减少炎性因子产生,并参与炎症反应和丝裂原活化蛋白激酶通路的转录后调节,减缓动脉粥样硬化的进程。而动脉粥样硬化的早期标志是泡沫细胞,它是巨噬细胞摄取氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)后所形成的。Tian 等[17]利用生物信息学确定了3个多功能转录因子的结合位点,并验证了这些转录因子的复合物可以抑制miRNA-155表达,降低巨噬细胞中的脂质,减慢巨噬细胞衍生成泡沫细胞的速度,减少动脉斑块形成。miRNA-202-3p被证实对原发性高血压病有重要作用[18],在一项病例对照试验中,发现冠心病病人的miRNA-202-3p表达显著升高,与血小板分布宽度和平均血小板体积呈负相关,进一步功能分析表明,ox-LDL可诱导miRNA-202-3p表达,并且miRNA-202-3p可以反馈抑制ox-LDL诱导泡沫细胞形成,起到拮抗冠心病的作用[19]。内皮细胞中的miRNA-126高表达具有调节炎症反应的功能[20-22],Wu等[23]研究证实在冠心病病人外周血单核细胞中miRNA-126表达相对降低,与炎性因子和细胞间黏附分子1呈负相关,与白细胞介素10呈正相关;有研究者提出miRNA-126是通过下调促炎因子、上调抗炎因子以达到控制炎症反应的目的[24-26]。

3.4 miRNA作为预测冠心病严重程度的标志物

目前,Gensini评分是用来评估冠状动脉造影测定血管病变严重程度的一种方法,以此为基准,有部分特异性RNA被认为可以成为预测冠心病冠状动脉狭窄严重程度的潜在标志。miRNA-126能调控炎症反应,且与Gensini评分呈负相关,故有研究者提出miRNA-126可用来预测冠心病风险和评估病情严重程度[23]。miRNA-223能调节多个脂代谢相关基因和控制高密度脂蛋白的摄取,在冠心病病人中miRNA-223表达较高,且与Gensini评分呈正相关,在预测冠心病严重程度方面存在一定的临床价值[27]。miRNA-208a是心脏特异性miRNA之一,可以通过调节肌球蛋白来影响心脏的发育[28]。研究证实miRNA-208a在冠心病AMI病人的心脏中表达水平较高,具有高灵敏度和强特异性,并且与Gensini评分呈正相关关系,故miRNA-208a被提议作为AMI的诊断标志物和冠状动脉狭窄程度的预测因子[29-30]。有研究者利用经皮冠状动脉支架介入术(PCI)诱导斑块破裂的实验结果确定了miRNA-155-5p、miRNA-483-5p、miRNA-451a在冠心病受试者中表达较高,并与斑块破裂存在着显著的关联性,故提出这3个miRNA有望成为早期识别斑块破裂的生物标志[31]。miRNA-221/222可以抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和分化,并诱导内皮功能障碍,还可以促进血管内皮细胞增殖、迁移和去分化,影响冠状动脉硬化的进展。另外,miRNA-221/222在急性冠状动脉综合征病人体内表达升高,且与Gensini评分呈正相关,提出miRNA-221/222在临床上对急性冠状动脉综合征且冠状动脉狭窄≥50%的病人具有诊断意义[32]。

3.5 多重基因网络参与冠心病的发生发展

不同类型的RNA具有不同的表达水平及生物学作用,通过相互作用来参与多种生理功能,运用生物信息学技术可以预测其基因靶点、信号通路,进一步证实RNA的表达及功能与冠心病的发生发展有重要性。lncRNA是大于200个非编码核苷酸的单链分子,是作为分子信号、诱导或者增强剂来调节基因的表达和功能[33]。lncRNA影响血管内皮细胞的增殖和迁移,调节血管内皮细胞的细胞周期和凋亡,以干预血管重塑,在冠心病和血管内皮细胞病变过程占有重要地位[29,34-35]。运用生物信息学分析和加权基因共表达网络分析冠心病病人的RNA,构建了9个lncRNA-miRNA-mRNA网络,检测了53个共表达的基因模块,冠状动脉血管内皮细胞增殖和迁移模型中,由5个lncRNA被下调,1个lncRNA被上调,6个共同表达的mRNA被上调,因此提出lncRNA可能成为调节血管内皮细胞增殖和迁移的靶点[36]。Liao 等[37]运用RNA的转录组测序以及基因相互作用构建lncRNA-miRNA-mRNA网络,在网络中有6个miRNA与左室射血分数(LVEF)、总胆固醇、高半胱氨酸关系密切,指出其中2个lncRNA、miRNA-449和mRNA(NR4A1)是关键基因并得到基因相互作用的证实,故提出lncRNA、miRNA-449、NR4A1可在临床上作为冠心病标志物。Zhu 等[38]发现在冠心病病人lncRNA MALAT1可直接靶向调控miRNA-15b-5p以促进细胞凋亡并抑制细胞自噬,影响冠心病进展。心肌缺血/再灌注(I/R)损伤实验证实lncRNA TTTY15可以通过靶向miRNA-374a-5p抑制细胞自噬和心肌I/R损伤[39]。

circRNA是一种存在于哺乳动物细胞中的非编码RNA,在外泌体含量丰富且稳定,通过miRNA海绵、剪接或转录因子来影响机体衰老、胰岛素分泌和组织发育。根据FEILIN团队的队列研究和基因本体(GO)富集分析,发现有110个circRNA、18个miRNA参与了冠心病的上调和下调,指出冠心病的潜在机制可能与circRNA-miRNA的共同表达、多途径、多细胞的分子生物学过程有关[40]。Ji 等[41]预测出miRNA的靶向相互作用并构建差异表达基因circRNA-miRNA-mRNA的三重网络,共鉴定出26 065个冠心病相关的基因,大部分基因都参与细胞周期、有丝分裂和细胞代谢过程,其中的10个基因与脂类代谢和蛋白质修饰相关,还指出circRNA可能通过miRNA海绵调节来影响冠状动脉疾病相关基因的表达。Pan等[42]运用数据库构建了一个由has-miR-130a-3p介导的circRNA-miRNA-ceRNA网络,证实了有9种circRNA通过抑制冠心病病人的has-miR-130a-3p来促进瞬时受体电位阳离子通道家族M成员3(TRPM3)的表达,提出has-miR-130a-3p具有预防和治疗冠心病的潜在能力。如上所述,miRNA的表达受到多重基因网络的影响,为冠心病的诊疗方案提供了新思路。

3.6 药物干预miRNA表达对冠心病的影响

miRNA-1是一种促进凋亡的心脏特异性miRNA,过度表达会降低细胞活力并诱导凋亡[43]。在冠心病AMI发生后miRNA-1含量迅速升高,其升高趋势与肌酸激酶同工酶相似,其表达水平与心肌梗死面积呈正相关,有望成为诊断AMI的敏感指标[44]。而卡维地洛是一种非选择性β-肾上腺素能受体拮抗剂,能通过抑制心肌细胞中miRNA-1的表达,增加直接靶点热休克蛋白60的部分表达,减少心肌细胞凋亡,以达到保护心肌的作用。有报道称他汀类药物能调节冠心病相关细胞中miRNA表达发挥其生物学作用[45],Li 等[46]运用生物信息学分析得出他汀类药物可能通过抑制血管生成、动脉粥样硬化相关细胞增殖、单核细胞迁移、血小板黏附以及miRNA介导的凝血级联反应,以增加动脉斑块的稳定。也有研究表明他汀类联合血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂(ARB)治疗可以降低冠心病病人的miRNA-146a/b表达和Toll样受体4(TLRA),有助于拮抗动脉粥样硬化[47]。丹红注射液是丹参和红花的标准提取物,在临床上长期被用于缺血性心脏病和缺血性脑病。一项miRNA PCR列阵结果显示,丹红注射液通过防止炎症转录因子的核转位,并逆转与炎症和细胞凋亡相关的miRNA,减轻心肌梗死相关炎症,有效减少心肌梗死面积,改善心功能[48]。

4 小 结

本研究将miRNA在冠心病领域中的相关研究以可视化知识图谱的形式进行相对直观的展示,结果显示miRNA是冠心病病理生理的关键介质,miRNA有望成为冠心病新型标志和潜在治疗靶点。但是,miRNA作为遗传因子,容易受到其他因素的影响,如环境因素,研究涉及多学科、跨领域,因此,miRNA的具体作用机制有待进一步探讨。目前出现的miRNA拮抗剂或者模拟物处于动物或者细胞实验的研究阶段,尚未有在临床上应用miRNA拮抗剂或者模拟物的相关研究,结合目前研究趋势,今后的相关研究可考虑以“实验室+临床”的研究模式开展。此外,本研究仅对2006—2021年在Web of Science核心合集中的相关文献进行分析,并未分析国内相关数据库的文献,内容存在着一定的局限性,可能会遗漏国内的重要研究,后续可结合国内外数据库进一步扩大检索范围,为更深入地探讨该研究领域的热点、前沿,为科研提供新思路,也为今后的冠心病诊疗提供有价值的实施方案。