李红英，张会军，王军，穆秀娥，李红方

（河北医科大学第一医院心脏外科，石家庄 050031）

急性心肌梗死 （acute myocardial infarction，AMI）是一种常见的心血管疾病，死亡率高，及时、有效的再灌注是减少AMI后心肌损伤的重要治疗选择［1］。研究［2］报道，心肌细胞凋亡、氧化应激参与了AMI的发病机制。心肌缺氧/复氧 （hypoxia/reoxygenation，H/R） 损伤与心血管外科手术高度相关［3］，预防H/R诱导的心肌细胞凋亡可能为AMI提供新的治疗策略。越来越多的研究表明，长链非编码RNA （long noncoding RNA，lncRNA） 在包括AMI在内的心血管疾病的生理和病理过程中发挥重要作用。核内小RNA宿主基因1 （small nucleolar RNA host gene 1，SNHG1） 作为一种lncRNA，已有研究［4］显示，下调SNHG1可以抑制心肌缺血/再灌注损伤小鼠的心肌细胞凋亡。但其具体分子机制尚不完全明确。研究［5］显示，过表达miR-145通过靶向下调程序性细胞死亡因子4 （programmed cell death 4，PDCD4） 抑制H/R诱导心肌细胞凋亡。生物信息学分析显示，SNHG1与miR-145-5p存在靶向关系。而SNHG1能否通过调控miR-145-5p/PDCD4轴影响H/R诱导的心肌细胞凋亡尚不明确。因此，本研究主要探讨了SNHG1对H/R诱导的心肌细胞凋亡的影响及其作用的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞：大鼠心肌细胞H9c2购自浙江美森细胞科技有限公司。

1.1.2 主要试剂：SNHG1小干扰RNA （si-SNHG1） 及其阴性对照 （si-NC）、miR-145-5p模拟物 （miR-145-5p mimic） 及其阴性对照 （mimic NC）、miR-145-5p抑制物 （miR-145-5p inhibitor） 及其阴性对照 （inhibitor NC），均购自赛默飞世尔科技 （中国） 有限公司；CCK-8试剂盒，购自上海继和生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒，购自无锡云萃生物科技有限公司；大鼠超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase，SOD）、丙二醛 （malondialdehyde，MDA） 试剂盒，购自上海广锐生物科技有限公司；兔源一抗PDCD4、caspase 3、Bcl-2、Bax、GAPDH及过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗，均购自英国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、H/R细胞模型的构建及实验分组：将H9c2细胞在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，培养条件为37 ℃和5% CO2。

H/R细胞模型的构建［6］：将H9c2细胞在缺氧培养箱 （37 ℃、94% N2、1% O2、5% CO2） 中培养24 h，再在复氧培养箱 （37 ℃、95%空气、5% CO2） 中复氧1 h。

将H9c2细胞分为H/R组、si-NC组、si-SNHG1组、mimic NC组、miR-145-5p mimic组、si-SNHG1+inhibitor NC组、si-SNHG1+miR-145-5p inhibitor组。上述各组细胞进行相应的转染处理48 h后，再进行缺氧24 h、复氧1 h。si-NC组、si-SNHG1组、mimic NC组、miR-145-5p mimic 组H9c2细胞分别转染si-NC、si-SNHG1、mimic NC、miR-145-5p mimic，si-SNHG1+inhibitor NC组H9c2细胞同时转染si-SNHG1和inhibitor NC，si-SNHG1+miR-145-5p inhibitor组H9c2细胞同时转染si-SNHG1和miR-145-5p inhibitor。同时取正常培养的H9c2细胞作为对照组 （NC组）。上述处理结束后，收集各组细胞用于后续实验。

1.2.2 实时定量PCR （real-time quantitative PCR，qRTPCR） 检测细胞中SNHG1、miR-145-5p表达：使用TRIzol试剂提取H9c2细胞中的总RNA，将总RNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板进行定量PCR。GAPDH、U6分别作为SNHG1、miR-145-5p内参。采用2-ΔΔCt法计算SNHG1、miR-145-5p相对表达量。引物序列：GAPDH，正向5’-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3’，反向 5’-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3’；SNHG1，正向5’-AACTTCCCATAACTCCACTTC-3’，反向5’-ACAACCAACACAGCAACAC-3’；miR-145-5p，正向5’-TCGGCAGGGTCCAGTTTTCCCA-3’，反向5’-CTCAAC TGGTGTCGTGGA-3’；U6，正向5’-CTCGCT TCGGCAGCACA-3’，反向5’-AACGCTTCACGAATTT GCGT-3’。

1.2.3 CCK-8检测细胞增殖：将各组H9c2细胞以1×104/孔的密度接种到96孔板中，培养48 h后，将10 μL CCK-8 试剂添加到96孔板的每个孔中，将96孔板在37 ℃下孵育1.5 h，使用酶标仪在450 nm处读取光密度值 （optical density，OD）。

1.2.4 流式细胞术检测H9c2细胞凋亡：将各组H9c2细胞用预冷的PBS洗涤2次，重悬于1×结合缓冲液中，然后在室温下依次与 5 μL Annexin V-FITC、5 μL碘化丙啶在黑暗条件下孵育5 min。使用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.5 试剂盒检测H9c2细胞中SOD活性、MDA含量：按照试剂盒说明书检测H9c2细胞中SOD活性、MDA含量。

1.2.6 Western blotting检测H9c2细胞中PDCD4、Bcl-2、caspase 3、Bax蛋白表达：RIPA裂解缓冲液裂解H9c2细胞并提取蛋白质，蛋白质经定量、电泳、转膜、封闭后，将膜与一抗PDCD4 （1 ∶2 000）、Bcl-2 （1 ∶2 000）、caspase 3 （1 ∶2 000）、Bax （1 ∶1 000）、GAPDH（1 ∶2 000） 在4 ℃下孵育过夜。随后，将膜与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗 （1 ∶1 000） 在室温下孵育 1 h，再次用TBST缓冲液洗涤膜3次，加入ECL试剂，观察蛋白质条带，使用ImageJ 分析蛋白灰度值。1.2.7 双荧光素酶报告基因实验：分别构建SNHG1野生型质粒 （SNHG1-WT） 和突变型质粒 （SNHG1-MUT），将SNHG1-WT和SNHG1-MUT分别与mimic NC或miR-145-5pmimic共转染于H9c2细胞，48 h后观察荧光素酶活性变化。

分别构建PDCD4野生型质粒 （PDCD4-WT） 和突变型质粒 （PDCD4-MUT），将PDCD4-WT和PDCD4-MUT分别与mimic NC或miR-145-5pmimic共转染于H9c2细胞，48 h后观察荧光素酶活性变化。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0软件处理数据。计量资料以x-±s表示，多组数据的比较采用单因素方差分析，进一步2组数据的比较采用SNK-q检验。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组H9c2细胞中SNHG1、miR-145-5p、PDCD4蛋白表达比较

与NC组比较，H/R组H9c2细胞中SNHG1、PDCD4蛋白表达升高，miR-145-5p表达降低 （P< 0.05）。与H/R组、si-NC组比较，si-SNHG1组H9c2细胞中SNHG1、PDCD4蛋白表达降低，miR-145-5p表达升高 （P<0.05）。与H/R组、mimic NC 组比较，miR-145-5p mimic组H9c2细胞中SNHG1表达变化的差异无统计学意义 （P> 0.05），miR-145-5p表达升高，PDCD4蛋白表达降低 （P< 0.05）。与si-SNHG1组、si-SNHG1+inhibitor NC组比较，si-SNHG1+miR-145-5p inhibitor组H9c2细胞中SNHG1表达变化的差异无统计学意义 （P> 0.05），miR-145-5p表达降低，PDCD4蛋白表达升高 （P<0.05）。见图1、表1。

表1 各组细胞中SNHG1、miR-145-5p、PDCD4蛋白表达比较 （n = 6）Tab.1 Cellular expressions of SNHG1，miR-145-5p，and PDCD4 protein by study group （n = 6）

图1 Western blotting检测各组细胞中PDCD4蛋白的表达Fig.1 PDCD4 protein expression detected by Western blotting in each study group

2.2 各组H9c2细胞增殖能力比较

NC组、H/R组、si-NC组、si-SNHG1组、mimic NC组、miR-145-5p mimic组、si-SNHG1+inhibitor NC组、si-SNHG1+miR-145-5p inhibitor组H9c2细胞OD450值分别为0.87±0.07、0.31±0.02、0.29±0.01、0.69±0.05、0.30±0.03、0.72±0.06、0.70±0.06、0.38±0.03。与NC组比较，H/R组H9c2细胞OD450值降低 （P< 0.05）；与H/R组、si-NC组比较，si-SNHG1组H9c2细胞OD450值升高 （P< 0.05）；与H/R组、mimic NC组比较，miR-145-5p mimic组H9c2细胞OD450值升高 （P< 0.05）；与si-SNHG1组、si-SNHG1+inhibitor NC组比较，si-SNHG1+miR-145-5p inhibitor组H9c2细胞OD450值降低 （P<0.05）。

2.3 各组H9c2细胞凋亡能力比较

NC组、H/R组、si-NC组、si-SNHG1组、mimic NC组、miR-145-5p mimic组、si-SNHG1+inhibitor NC组、si-SNHG1+miR-145-5p inhibitor组H9c2细胞凋亡率分别为 （3.79±0.14） %、 （18.86±1.15） %、 （18.72±1.12） %、（6.78±0.34） %、 （18.80±1.07） %、 （5.49±0.26） %、（6.69±0.29） %、 （13.34±1.17） %。与NC组比较，H/R组H9c2细胞凋亡率升高 （P< 0.05）；与H/R组、si-NC组比较，si-SNHG1组H9c2细胞凋亡率降低 （P< 0.05）；与H/R组、mimic NC组比较，miR-145-5p mimic组H9c2细胞凋亡率降低 （P< 0.05）；与si-SNHG1组、si-SNHG1+inhibitor NC组比较，si-SNHG1+miR-145-5p inhibitor组H9c2细胞凋亡率升高 （P< 0.05）。见图2。

图2 流式细胞术检测H9c2细胞凋亡Fig.2 H9c2 cell apoptosis detected by flow cytometry

2.4 各组H9c2细胞中SOD活性、MDA含量比较

与NC组比较，H/R组H9c2细胞中SOD活性降低，MDA含量升高 （P< 0.05）；与H/R组、si-NC组比较，si-SNHG1组H9c2细胞中SOD活性升高，MDA含量降低 （P< 0.05）；与H/R组、mimic NC 组比较，miR-145-5p mimic 组H9c2细胞中SOD活性升高，MDA含量降低（P< 0.05）；与si-SNHG1组、si-SNHG1+inhibitor NC组比较，si-SNHG1+miR-145-5p inhibitor组H9c2细胞中SOD活性降低，MDA含量升高 （P< 0.05）。见表2。

表2 各组H9c2细胞中SOD活性、MDA含量比较 （n = 6）Tab.2 SOD activity and MDA content of H9c2 cells by study group （n = 6）

2.5 各组H9c2细胞中Bax、Bcl-2、caspase 3蛋白表达比较

与NC组比较，H/R组H9c2细胞中Bax、caspase 3蛋白表达升高，Bcl-2蛋白表达降低 （P< 0.05）；与H/R组、si-NC组比较，si-SNHG1组H9c2细胞中Bax、caspase 3蛋白表达降低，Bcl-2蛋白表达升高 （P<0.05）；与H/R组、mimic NC 组比较，miR-145-5p mimic组H9c2细胞中Bax、caspase 3蛋白表达降低，Bcl-2蛋白表达升高 （P< 0.05）；与si-SNHG1组、si-SNHG1+inhibitor NC组比较，si-SNHG1+miR-145-5p inhibitor组H9c2细胞中Bax、caspase 3蛋白表达升高，Bcl-2蛋白表达降低 （P< 0.05）。见图3、表3。

表3 各组H9c2细胞中Bax、Bcl-2、caspase 3蛋白表达比较 （n = 6）Tab.3 Bax，Bcl-2，and caspase 3 protein expression of H9c2 cells by study group （n = 6）

2.6 SNHG1靶向调控miR-145-5p /PDCD4轴

在Starbase （http：//starbase.sysu.edu.cn/）、Target Scan （https：//www.targetscan.org/vert_72/） 网站分别预测lncRNA SNHG1与miR-145-5p、miR-145-5p与PDCD4的结合位点，见图4。与mimic NC和 SNHG1-WT共转染组比较，miR-145-5p mimic和 SNHG1-WT共转染组的荧光素酶活性降低 （分别为1.05±0.12和0.23±0.01，P< 0.05）；与mimic NC和SNHG1-MUT共转染组比较，miR-145-5p mimic和 SNHG1-MUT共转染组荧光素酶活性无显著变化 （分别为1.03±0.11和1.02±0.10，P> 0.05）；与mimic NC和PDCD4-WT共转染组比较，miR-145-5p mimic和PDCD4-WT共转染组的荧光素酶活性降低 （分别为1.03±0.10和0.29±0.02，P< 0.05）；与mimic NC和PDCD4-MUT共转染组比较，miR-145-5p mimic和PDCD4-MUT共转染组荧光素酶活性无显著变化 （分别为0.97±0.08和1.01±0.09，P> 0.05）。

图4 Starbase、TargetScan网站分别预测lncRNA SNHG1与miR-145-5p、miR-145-5p与PDCD4的结合位点Fig.4 Binding sites of lncRNA SNHG1 and miR-145-5p as well as of miR-145-5p and PDCD4 predicted at Starbase and TargetScan websites

3 讨论

AMI是冠状动脉急性闭塞引起的心肌损伤，严重威胁人类生命健康。尽管 AMI 的诊断和治疗在过去几十年中有所进展，但全世界其发病率和死亡率仍在上升［7］。因此，早期发现和干预对于减少心肌损伤和改善患者预后是必要的。

SNHG1是一种新发现的lncRNA，研究［8］报道，沉默SNHG1可抑制脓毒症小鼠心肌损伤；敲低SNHG1可抑制脂多糖诱导的PC12细胞凋亡［9］。以上研究表明，SNHG1在调控细胞凋亡和心肌损伤方面具有重要作用。SOD和MDA是氧化应激的标志物；Bax、Bcl-2、caspase 3是常用于评估细胞凋亡的蛋白，Bcl-2是一种抗凋亡蛋白，而Bax、caspase 3是促凋亡效应蛋白。本研究显示，SNHG1在H/R诱导的H9c2细胞中高表达，沉默SNHG1可抑制H/R诱导的H9c2细胞凋亡和氧化应激，提示SNHG1可能是治疗AMI的潜在有效靶点。

lncRNA可通过海绵化微RNA （microRNA，miRNA）发挥作用。本研究通过生物信息学分析和双荧光素酶报告基因实验，证实SNHG1与miR-145-5p 存在靶向关系。miR-145-5p作为一种miRNA，已有研究报道，下调miR-145-5p可加重心肌梗死小鼠心肌损伤［10］，过表达miR-145-5p可减轻心肌缺血/再灌注损伤中的细胞凋亡［11］。以上研究表明，miR-145-5p在AMI进展中发挥重要调控作用。本研究结果与上述研究结果一致，本研究显示，miR-145-5p在H/R诱导的H9c2细胞中低表达，过表达miR-145-5p可抑制H/R诱导的H9c2细胞凋亡和氧化应激。此外，本研究还发现沉默SNHG1可上调H/R诱导的H9c2细胞中miR-145-5p表达，推测沉默SNHG1可能通过上调miR-145-5p抑制H/R诱导的H9c2细胞凋亡和氧化应激。为了验证这一推测，本研究在沉默SNHG1的基础上应用miR-145-5p inhibitor干预H/R诱导的H9c2细胞，结果显示，miR-145-5p inhibitor减弱了沉默SNHG1对H/R诱导的H9c2细胞凋亡和氧化应激的影响。本研究证实了这一推测，即沉默SNHG1可能通过上调miR-145-5p抑制H/R诱导的H9c2细胞凋亡和氧化应激。

miRNA是一类非编码RNA，通过与其靶基因mRNA的3’非翻译区结合，在转录后水平负调控基因表达。本研究证实了PDCD4为miR-145-5p的靶基因。PDCD4基因定位于染色体10q24上［12］。研究显示，沉默PDCD4能够减弱H/R诱导的心肌细胞凋亡和氧化应激损伤［13］，抑制PDCD4可抑制阿霉素诱导的大鼠心肌细胞凋亡［14］。以上研究表明，PDCD4在调控心肌细胞凋亡和氧化应激方面发挥重要作用。本研究显示，PDCD4蛋白在H/R诱导的H9c2细胞中高表达，沉默SNHG1后，H/R诱导的H9c2细胞中miR-145-5p表达升高，而PDCD4蛋白表达降低，双荧光素酶报告基因实验证实了SNHG1与miR-145-5p、miR-145-5p与PDCD4存在靶向关系。证实了沉默SNHG1可能通过调控miR-145-5p/PDCD4轴，抑制H/R诱导的H9c2细胞凋亡和氧化应激。

综上所述，沉默SNHG1可能通过上调miR-145-5p来抑制PDCD4表达，进而抑制H/R诱导的H9c2细胞凋亡和氧化应激。本研究尚存在不足之处，仅进行了体外实验，未进行体内实验探究SNHG1对H/R诱导的H9c2细胞凋亡的影响，后期将进行进一步体内研究。