陈思源,项永晶,李正胜,谢娟,黄波,黄海平,汪丹丹,赵姣,李亿,陈静

膜性肾病(MN)是以肾小球基底膜上皮细胞下免疫复合物的沉积和基底膜(GBM)增厚为特征的一种自身免疫性疾病,是常见的肾病综合征类型之一,以大量蛋白尿、低蛋白血症、水肿、高脂血症等为临床表现[1-2]。MN可分为原发性膜性肾病(PMN)和继发性膜性肾病(SMN);PMN较为常见,占75%～80%[3]。PMN患者10年内约1/3能自发缓解,约1/3在治疗后仍会进展为终末期肾脏病[1];现代医学治疗主要为激素联合免疫抑制剂,临床疗效明显,但存在不良反应、药物撤减困难及病情反复、肝肾毒性大等问题[4]。中医学近年对PMN的认识不断深入,国内研究显示中西医结合治疗PMN的临床效果优于单纯西药治疗[5-6]。

网络药理学是基于系统生物学理论的新学科,能从整体探索药物与疾病的关联性,提高药物治疗效果、减少不良反应,指导新药研发和提高新药临床试验成功率[7]。

1 材料与方法

1.1 靶点筛选 应用中药系统药理学数据库和分析平台TCMSP,以“地锦草”为关键词搜索,筛选出口服生物利用度≥30%且类药性≥0.18的信息。应用蛋白质序列和功能信息资源数据库Uniprot将有效成分的靶点与基因名进行匹配,得到中药靶点。应用Gene Cards疾病数据库,以“primary membranous nephropathy”为关键词进行检索,得到疾病靶点。

1.2 地锦草和PMN交集靶点的获取及蛋白互作(PPI) Venny中获取地锦草与PMN交集靶点,导入String数据库,限定物种为“Homo Sapiens”,设置最低置信度≥0.90,构建PPI网络;将PPI网络图下载并上传至Cytoscape软件中,根据Degree值筛选核心靶点。

1.3 GO和KEGG富集分析及数据可视化 利用Metascape数据库进行GO生物功能分析,得到生物过程(BP)、细胞成分(CC)、分子功能(MF)三组条目,以P<0.05的条件进行筛选,各取前20个条目,即组成60个条目在“微生信”在线绘图工具中进行可视化;利用Metascape数据库进行KEGG富集通路分析,限定物种为“Homo Sapiens”,制作KEGG富集气泡图。将地锦草成分-PMN靶点—数据导入Cytoscape软件中进行可视化。

1.4 核心成分与核心靶点的分子对接 基于蛋白质数据库PDB和Pub Chem数据库下载成分和靶蛋白结构,基于AutoDock tool进行分子对接,使用Pymol进行可视化。

2 结 果

2.1 靶点筛选 地锦草有7个有效成分,包括MOL001002、MOL000359、MOL000422、MOL006321、MOL006326、MOL006331、MOL000098。255个药物靶点,利用Uniprot数据库删除重复值,成功匹配到136个中药靶点。基于Gene Cards数据库,以“primary membranous nephropathy”为关键词进行检索,得到3 592个疾病靶点。

2.2 地锦草有效成分与PMN PPI网络的构建及主要靶点的筛选 102个交集靶点(图1)导入String数据库中,构建PPI网络并进行分析。结果显示,网络共包含102个蛋白质,蛋白质之间有1 798个关联信息,有效成分靶点—疾病靶点网络中每个节点平均相连35.3条边,见图2(第181页)。将PPI网络图下载并上传至Cytoscape软件中,对结果进行拓扑分析后得到关联度最高的4个核心靶点RELA、MAPK1、TP53、AKT1,见图3。

图1 地锦草与PMN的交集靶点

图2 地锦草有效成分与PMN的 PPI网络图

图3 地锦草治疗PMN的主要靶点网络图

2.3 GO生物功能富集分析 在Metascape数据库中分析GO生物功能,得到BP条目1 449个,CC条目61个,MF条目135个,以P<0.05的条件分别进行筛选,各取前20个条目,结果显示,在地锦草有效成分与PMN的交集靶点中,BP主要集中在肿瘤坏死因子反应、细胞对脂多糖的反应和细胞来源分子的细胞反应等;CC主要集中在丝氨酸蛋白酶抑制剂复合物、蛋白酶抑制剂复合物和肽酶抑制剂复合物等;MF主要集中在转录辅调节子结合、DNA结合转录激活物活性和核受体活性、配体激活的转录因子活性等,见图4。

图4 GO功能富集分析图

2.4 KEGG通路富集分析 在Metascape数据库中进行KEGG富集通路分析,得到相关性最高的前20条信号通路(P<0.01),结果显示,富集显著性最高的前3条通路分别是:癌症通路、脂质和动脉粥样硬化、流体剪切力和动脉粥样硬化,见图5。

图5 KEGG通路气泡图

2.5 地锦草有效成分—交集靶点—通路网络的构建 通过Cytoscape软件中的“Analyze Network”工具得到地锦草有效成分—交集靶点—通路网络图,见图6(第181页)。根据Degree值显示,前2位有效成分是:槲皮素、山奈酚,4位核心靶点是:TP53、AKT1、MAPK1、RELA,且上述靶点均富集于癌症通路与HIF-1信号通路中,由此可见,癌症通路及HIF-1信号通路可能是地锦草治疗PMN机制的重要通路之一。

2.6 分子对接 将地锦草治疗PMN的核心成分槲皮素和山奈酚分别与核心靶点TP53、AKT1、MAPK1、RELA进行分子对接,根据阈值得到8组配体—受体对接结果,以结合能筛选结合活性较好的靶点,其中结合能≤-5 kcal/mol认为配体与靶点之间具有较好的结合活性。TP53、AKT1、MAPK1、RELA与槲皮素和山奈酚均具有很好的结合活性,其中,槲皮素、山奈酚与TP53的结合活性最强,见表1。

表1 分子对接结果

3 讨 论

PMN是国内外引起肾病综合征的常见病理类型之一,其治疗无特异性[8];地锦草是医院肾内科治疗肾脏病的常用中药,前期研究表明地锦草对肾小球疾病的治疗安全有效,但机制尚不清楚[9]。

本文筛选出地锦草的有效成分槲皮素和山奈酚,可能是地锦草治疗PMN的核心成分。槲皮素具有抗炎、抗氧化特性,且能通过拮抗肿瘤坏死因子-α诱导的NF-κB/β-catenin信号通路,阻断NF-κB活化,改善肾损伤[10]。NF-κB是介导MN肾损伤多条信号通路中的一条,它调控许多参与PMN发生发展过程的基因表达;同时能调控IL-1、IL-6、IL-8等参与机体炎性反应过程[11];它通过引起感染、损伤或自身免疫因素参与实验和人类肾脏炎性相关疾病的发生[12]。山奈酚具有抗炎作用,可抑制自由基引起的氧化应激反应和肾损伤[13-14];山奈酚通过调节AMPK/NOX4通路,发挥肾脏保护作用,同时能抑制肾癌细胞增殖[15-16]。

TP53是一种转录因子,有研究表明TP53对MN肾脏病理有一定提示作用[17];最近一项研究表明TP53与肾损伤密切相关[17];TP53可抑制mTOR,增强自噬,调节自噬水平,可明显减少足细胞损伤延缓MN进展,自噬存在PMN中[18];在肾病中,TP53也是肾小管细胞损伤和凋亡的主要递质[19]。MAPK1的激活与炎性反应、氧化应激和凋亡相关[20];通过激活的MAPK1诱导花生四烯酸促进NF-κB信号通路可引起肾脏细胞损伤[21],在Wang等[22]研究中过度激活的NF-κB通路与巨噬细胞诱导的肾纤维化相关。AKT1是P13K重要的下游因子,P13K/AKT参与了肾纤维化过程;Lin等[23]研究表明AKT1信号传导可减轻肾损伤,保护肾功能,并显著提高缺血再灌注损伤后的存活率(分别为76.9%和20.8%);AKT1可能参与药物治疗MN过程。RELA是NF-κB家族成员,NF-κB的激活是MN肾脏疾病慢性炎性反应的关键[24]。HIF-1信号通路是有机体的低氧应激通路,且对维持内环境稳态起着关键作用。

4 小 结

地锦草治疗PMN可能是槲皮素、山奈酚通过NF-κB及HIF-1信号通路作用于TP53、AKT1、MAPK1、RELA靶点,通过降低炎性反应水平、抑制肾脏纤维化等机制对MN发挥作用。虽本研究体现了多成分、多靶点、多通路的特点,可为地锦草治疗PMN提供新思路,但网络药理学仍存在一定局限性,本文的研究结果仍需通过相关实验进一步研究证实。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突。