刘德良,季敏敏,黄超君,黄熠阳,杨兴婷,鲍蕾蕾

缺血性脑卒中(CIS)是一种高发病率、高复发率、高致残率和高致死率的脑血管疾病[1]。CIS发病机制复杂,目前研究认为其病理机制包括能量代谢障碍、炎性反应、细胞凋亡等[2-4]。CIS属中医“中风”范畴,其主要病因为气虚血瘀。疏血通注射液具有活血化瘀、通经活络功效,以水蛭、地龙为原料提取制成。临床上对CIS的治疗,疏血通注射液应用广泛、疗效显著,但目前疏血通注射液治疗CIS的作用机制尚未明确[5-6]。

网络药理学是一种提供“多靶点、多通路、多环节”的新型网络模式,已被大量应用于系统揭示中药对疾病作用的物质基础和效应机制[7]。本研究运用网络药理学方法预测疏血通注射液治疗CIS的主要活性成分、作用靶点和相关信号通路,分析疏血通注射液治疗CIS的可能药理作用,现报道如下。

1 资料与方法

1.1 疏血通注射液活性成分和作用靶点的获取 通过BATMAN-TCM数据库分别搜集水蛭、地龙两味中药的主要化学成分,并结合已发表的中药成分相关文献进行补充[8-11]。利用PubChem数据库检索各化学成分的SMILES结构,将各化学成分的SMILES结构上传至SwissADME平台进行活性筛选[12]。最后在SwissTargetPrediction平台预测潜在靶点[13]。

1.2 CIS疾病靶点信息获取 在GeneCards数据库中以“Cerebral Ischemic Stroke”“CIS”为关键词获取CIS潜在靶点。在GeneCards数据库中,靶点Score值越大表明该靶点与疾病联系越紧密。当获取结果靶点过多时通常筛选Score值大于中位数的靶点作为疾病的潜在靶点。

1.3 构建“疏血通注射液—活性成分—作用靶点网络” 将疏血通注射液药物相关靶点与CIS疾病靶点利用Venny 2.1网站取交集,得到疏血通注射液治疗CIS的作用靶点。将交集靶点及对应的中药成分数据导入Cytoscape 3.9.1软件中,构建药物—成分—靶点网络,通过计算网络节点度值筛选主要活性成分。

1.4 构建蛋白质—蛋白质相互作用(PPI)网络 将1.3项下所得到的交集靶点导入STRING 11.5数据库,设置物种为“智人”,选择隐藏游离靶点,获得PPI网络。保存PPI网络的tsv文件,导入Cytoscape 3.9.1软件进行可视化,通过内置分析功能筛选核心靶点。

1.5 GO分析和KEGG富集分析 将交集靶点导入DAVID数据库,物种设定为“智人”,基因修正为“official gene symbol”,分别进行GO和KEGG分析。根据P值选取GO分析排名前十的条目和KEGG富集分析排名前二十的进行可视化。

1.6 分子对接验证 为进一步分析疏血通注射液对CIS的调控作用,将1.3项中获取的主要活性成分,与1.4项中筛选得到的核心靶点进行分子对接验证。首先从PubChem网站下载药物主要有效成分的3D结构,通过AutoDock Tools 1.5.7优化结构后设置为配体并保存。然后从RCSB PDB数据库获取关键靶点的3D结构,使用Pymol 2.5.0软件对蛋白结构进行去除水分子和自身配体,再使用AutoDock Tools 1.5.7进行加氢后设置为受体并保存。最后利用AutoDock Vina 1.2.0进行分子对接。

2 结 果

2.1 疏血通注射液活性成分和作用靶点的获取 综合BATMAN-TCM数据库检索结果及文献信息,将所搜集成分经SwissADME平台进行活性筛选后,最终获得水蛭活性化合物17个,地龙活性化合物49个,二者共有成分22个,主要为核苷类和氨基酸类物质。利用SwissTargetPrediction平台将具有活性的化合物在设定筛选条件下进行靶点预测,获得水蛭作用靶点548个,地龙作用靶点901个。经合并重复项及删除无对应靶点成分后最终获得疏血通注射液活性化合物88个和对应靶点952个。

2.2 CIS疾病靶点信息获取 通过检索GeneCards数据库,初步获得CIS疾病相关靶点3 151个。这些靶点中Score最大值为136.04,最小值为0.27,中位数为3.42,设定Score值>3.42的靶点为CIS潜在靶点,共1 575个。

2.3 “疏血通注射液—活性成分—作用靶点”网络 将疏血通注射液活性成分作用靶点与CIS潜在靶点上传到Venny 2.1网站取交集,得到疏血通注射液治疗CIS潜在靶点351个。利用Cytoscape 3.9.1软件绘制疏血通注射液“药物—成分—靶点”网络图,该网络包含443个节点,2 340条边,见图1。该网络节点的平均自由度为10.41,共有136个节点自由度≥11,其中61个为疏血通注射液有效成分,75个为疏血通注射液治疗CIS的相关靶点。网络中节点自由度越大,表明该成分越重要,选取自由度值排名前10位的有效成分作为疏血通注射液主要有效成分,见表1。以拼音首字母为编码标准,水蛭成分编号为SZ1～SZ17,地龙成分编号为DL1～DL49,共有成分编号为GY1～GY22。

图1 疏血通注射液“药物—成分—靶点”网络图

表1 疏血通注射液主要有效成分基本信息

2.4 PPI网络构建与分析 在STRING 11.5数据库上传2.3项得到的交集靶点进行PPI分析,并保存tsv文件导入Cytoscape 3.9.1软件进行可视化,删除游离主网络外的靶点后得到疏血通注射液治疗CIS靶点PPI网络图,见图2。该PPI网络节点数为291,边数为1 314。利用CtoNCA插件中介数中心性(BC)算法计算靶点得分,BC值越大,节点越大,颜色越深,说明该靶点在网络中越重要。其中排名前5位的靶点有SRC、ESR1、CTNNB1、STAT3、SIRT1。

图2 疏血通注射液治疗CIS潜在靶点PPI网络图

2.5 GO富集和KEGG通路分析 利用DAVID数据库,对疏血通注射液治疗CIS的潜在靶点进行GO富集和KEGG通路分析。在GO富集中,得到生物过程(BP)350条,细胞组成(CC)351条,分子功能(MF)351条。根据P值可视化分析结果中排名前10位的条目,见图3。结果显示BP主要涉及药物反应、炎性反应、低氧反应等;CC主要涉及质膜、质膜组成部分、细胞表面等;MF主要涉及蛋白结合、相同蛋白结合、酶结合等。

图3 疏血通注射液治疗CIS潜在靶点GO功能富集分析图

KEGG通路分析共得到334条通路,根据P值对分析结果中排名前20位的条目进行可视化,见图4。图4中X轴表示富集倍数,Y轴为富集到的通路名称,富集结果的P值以颜色表示,基因数以气泡大小表示。颜色越红、气泡越大表明富集程度越高。疏血通注射液治疗CIS的信号通路包括:癌症途径、神经元神经活性配体—受体相互作用、脂质与动脉粥样硬化、钙离子信号、CAMP信号等通路。

图4 疏血通注射液治疗CIS潜在靶点KEGG通路富集分析气泡图

2.6 分子对接 根据1.3项分析结果,依据度值筛选主要活性成分的同时兼顾两种药物,因此选择来自地龙的DL1、DL14和来自水蛭的SZ7这3个成分与从PPI网络图中选取BC值排名前5位的靶点蛋白SRC、ESR1、SIRT1、CTNNB1、STAT3进行分子对接预测结合能,见表2。一般认为分子对接结合能<0,表明配体与受体可自由结合,结合能≤-5.0 kJ/mol表明小分子配体与受体结合较好[14],结合能越低表明配体与受体之间的亲和力越大,二者发生相互作用的可能性越高。结果显示来自地龙的DL1和来至水蛭的SZ7与各个靶点亲和力较好,而SRC、ESR1、STAT3与各个成分之间对接结果较好,可能在疏血通注射液治疗CIS中起着重要作用。

表2 疏血通注射液主要活性成分与关键靶点对接结果

3 讨 论

CIS主要病因是动脉供血短暂或永久缺少导致脑组织缺血缺氧,进而引起神经损伤、炎性反应等。疏血通注射液具有活血化瘀、通经活络功效,临床用于瘀血阻络所致的中风病,而气虚血瘀是CIS的病机。补气活血法是治疗CIS重要思路。本研究预测疏血通注射液主要有效活性活性成分共10个,其中来自地龙9个即(S)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-5-乙氧基-5-氧代戊酸、4-辛烷氧基苯胺、二氢辣椒素、麦角胺、4,8,12-三甲基十三碳-3,7,11-三烯酸甲酯、亚麻酸、二十二碳五烯酸、棕榈烯酸、邻苯二甲酸二甲氧乙酯,来自水蛭1个(水蛭素A)。钟晓芃等[15]研究发现含氮化合物二氢辣椒素能激活TRPV1受体可通过cAMP/PKA信号通路,增加线粒体解偶联蛋白表达,提高被缺血再灌注损伤降低的线粒体膜电位,减少ROS产生,抑制凋亡因子释放,从而减少缺血再灌注损伤导致的神经元细胞凋亡。麦角类生物碱麦角胺可用于治疗偏头痛,而偏头痛是导致脑卒中发生的危险因素[16]。不饱和脂肪酸类物质亚麻酸、二十二碳五烯酸等,具有降血脂、抗炎、抗氧化等药理作用[17]。

PPI网络分析结果发现,疏血通注射液可能主要通过SRC、ESR1、CTNNB1、SIRT1、STAT3 5个核心靶点发挥治疗CIS的作用。PPI网络中SRC的BC值最大,且分子对接结果显示SRC与疏血通注射液主要活性成分均能稳定结合,预测SRC是疏血通注射液治疗CIS的最主要靶点。SRC酪氨酸蛋白激酶可经过氧化还原作用,调节血管内皮生长因子、偶联因子6、缓激肽等,进而改变血管结构和功能,在心脑血管疾病如高血压、脑卒中发挥主要作用[18]。ESR1即雌激素受体α,雌激素已被证明能增加脑血流量,具有抗炎作用,增强神经元突触处的活性,对脑组织发挥直接的神经保护和神经营养作用。徐伟等[19]研究发现由于脑缺血再灌注损伤后大鼠脑组织水肿,大鼠Notch信号通路被激活,调节CTNNB1与KRT1高表达以缓解大鼠脑组织水肿。已有研究发现脑缺血再灌注过程中SIRT1持续低表达,上调SIRT1能抑制脑缺血再灌注过程中炎性反应和细胞凋亡,减轻脑缺血再灌注损伤[20]。STAT3是炎性反应发展过程中的关键节点,可通过介导炎性递质的细胞外信号调控免疫细胞、肿瘤细胞等的生物学行为,是慢性炎性反应促进肿瘤发生及肿瘤相关性炎症形成过程中不可或缺的关键性分子[21]。

GO富集及KEGG通路分析结果表明,疏血通注射液治疗CIS可能与癌症途径、神经元神经活性配体—受体相互作用、脂质与动脉粥样硬化通路、钙离子信号、CAMP信号等通路相关,其中癌症途径是一条重要且复杂的通路,包含PI3K/AKT、IL-6、NF-κB、MAPK等通路。PI3K/AKT信号通路参与细胞增殖、存活和凋亡等多种生物学过程,对大脑缺氧缺血后神经细胞凋亡具有重要调控作用,减轻缺氧/缺血再灌注损伤[22]。IL-6虽是炎性细胞因子,在CIS急性期明显升高,但在亚急性期和慢性期又可作为神经营养介质,参与脑缺血后损伤修复过程。p38MAPK是MAPK中一条关键信号通路,脑部缺血缺氧时可引起MAPK信号通路的激活从而促进神经元凋亡[23]。NF-κB是p38MAPK的下游分子,p-p38MAPK可激活NF-κB,通过调节细胞凋亡相关基因表达诱导神经元凋亡,抑制p38MAPK通路和NF-κB的激活,从而减少TNF-α、IL-1β和IL-6等细胞因子释放,减轻脑组织损伤[24]。

综上所述,本研究采用网络药理学方法探索疏血通注射液治疗CIS可能的分子机制,发现疏血通注射液的主要活性成分为(S)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-5-乙氧基-5-氧代戊酸、水蛭素A等物质,可能通过作用于SRC、ESR1、SIRT1、CTNNB1、STAT3等靶点,在癌症途径、神经元神经活性配体—受体相互作用、脂质与动脉粥样硬化、钙离子信号、CAMP信号等通路发挥治疗CIS作用。疏血通注射液作用机制涉及多种分子、过程、通路,体现了中药多成分、多靶点、多通路的特点。同时本研究存在一定不足,结论得出主要基于数据库和相关文献,缺少动物实验对筛选出的关键靶点和信号通路进行验证和进一步研究。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突。