徐岚，胡泉，黄丽丽

咸宁市中心医院（湖北科技学院第一附属医院）生殖中心，湖北咸宁 437100

据研究报道，中国大约有15%的育龄夫妇面临不孕不育困境[1]。当前，临床对男性生育力的评估主要依据WHO 标准通过对精子浓度、精子活力、形态等指标来判断，只能反映精液的一般现状，即使检测正常也可能被诊断为不育，临床上需要寻找能预测男性生育能力的检测方法[2]。当前研究表明，高龄患者体内活性氧（reactive oxygen species, ROS）自由基过度产生会损伤精子DNA，导致精子受精能力下降[3]，因此高龄对男性精子的DNA 完整性可能存在不利影响[4]。而又有研究表明，男性精子头部DNA 完整性（DNA fragmetation index of sperm, DFI）受损可能会增加其配偶发生复发性流产的风险[5]，因此完善精子DNA 碎片的检测对男性生育力的评估非常重要。本研究回顾性分析2021 年8 月—2022 年8 月在咸宁市中心医院生殖医学中心就诊的503 例男性患者的精液常规指标和DFI 指数，分别按照年龄和DFI 指数分组，探讨不同年龄组、不同DFI 组精液质量的差异。现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

在获得患者及其家属知情并同意的情况下选取在本院生殖医学中心就诊的503 例男性患者作为研究对象，年龄23～50 岁。此次研究获得咸宁市中心医院生殖医学中心伦理委员会批准。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：男性身体健康，无睾丸外伤，无家族遗传性疾病及性功能障碍病史，无不良生活习惯（嗜烟、嗜酒、吸毒等）；无腮腺炎病史；男性体征明显，睾丸、附睾及输精管体检无明显异常。排除标准：患者无遗传性疾病家族史、无隐睾、睾丸肿瘤、无精症、精索静脉曲张、腮腺炎病史等。

1.3 方法

1.3.1 标本采集 患者在取精前禁欲2～7 d，洗净双手手淫法取精，且精液完整取出收集在取精杯内，称重后立即放置于37℃恒温箱内温育至完全液化后检验。

1.3.2 精液常规检测 用3 mL 巴斯德吸管上下吹吸使精液完全液化，充分混匀后移液器取10 ul 精液样本于makler 计数板加样池中，然后采用计算机辅助精液分析系统（CASA BEION V4.2）对男性精液参数进行分析。

1.3.3 精子形态学检测 将精液标本制片干燥至少4 h并采用改良巴氏染色法染色，制片完成后将由检验人员按照第五版操作手册[6]正常精子判定标准在100 倍油镜下筛选至少200 条精子，并计算正常精子形态百分率，≥4%即为正常。

1.3.4 精子染色质结构分析 将适量精液标本，用缓冲液稀释成浓度为（1.5～2.0）×106/mL 的100 μl 精子悬液，然后与200 μl 酸处理液混匀30 s，再加入600 μl 吖啶橙染液进行染色，再将标本置于流式细胞仪检测，每个待检测精液标本至少检测1 000 个精子，吖啶橙染液对精子核进行染色，用于评估单链和双链DNA 的比例。采用精子DFI 表示精子DNA 损伤的程度，并对研究对象进行分组。目前临床上用于检测DNA 损伤的方法主要有：彗星实验，精子染色体结构检测（sperm chromatin structure assay, SCSA），精子染色质扩散实验（sperm chromatin diffusion, SCD），TUNEL 检测以及基于荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH）技术等。与其他检测方法相比SCD 是一种性价比高的检测方法且已经广泛应用于临床。

1.4 观察指标

根据WHO《人类精液检查与处理实验室手册》（第5 版）[6]精液各项参数的参考标准如下：禁欲天数：2～7 d，精液体积≥1.5 mL，pH:7.2～8.0，精子浓度≥15×106/mL，精子总数≥39×106个，前向运动精子PR≥32%，总活力PR+NP≥40%，不动精子IM＜60%，正常精子形态≥4%，精子DNA 碎片指数（DFI）参考值＜25%。

1.5 统计方法

采用SPSS 26.0 统计学软件分析数据，非正态分布采用中位数(四分位间距)[M（P25，P75）]来描述，方差不齐采用多个独立样本的非参数（Kruskal-Wallis H）检验法对数据进行分析。对于不服从双变量正态分布的计量资料进行spearman 秩相关性分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同程度DFI 组男性精液参数比较

3 组结果分析表明，年龄越大，DFI 指数越高，不动精子占比越高，而精子总活力越低，正常精子形态率越低，差异有统计学意义（P＜0.05），其他参数比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.2 男性精子DFI 与年龄、精液常规参数的相关分析

精子DFI 与患者年龄、不动精子呈正相关（P＜0.001）；与精子总活力、精子正常形态率呈负相关（P＜0.001）；而其他参数与精子DNA 碎片不存在相关性（P＞0.05），见表2。

表2 精子DFI 与年龄、精液参数的相关性分析

3 讨论

研究表明，高龄、吸烟、生活作息不规律等不良生活习惯等因素会影响精子产生、降低精子质量和损害精子功能，导致精子DNA 受损和男性不育[7]。学者们对男性不育患者的年龄与其精子DFI 相关性的研究比较多，且一致认为DFI 水平越高，显示研究对象年龄越大，这类似的结果也在一些研究中得到证实，例如当男性年龄＞35 岁时精液质量开始下降；20～35 岁组精子DNA 碎片率显著低于36～57岁[8-9]等，本文结果也证实了这一点。高龄之所以影响男性生育力，其机制可能是高龄男性睾丸结构及功能发生异常改变，而精液内活性氧自由基浓度升高，同时伴随体内抗氧化能力减弱，继而造成精子头部DNA 单链或双链出现损伤和断裂，影响男性生育功能[10]。另外其他精液参数分析结果显示，随着DFI 水平的增加，精子总活力下降、正常形态精子率显著降低，不动精子占比增加；相关性分析结果显示，精子DFI 与患者年龄、不动精子呈正相关，与精子总活力、精子正常形态率呈负相关，而与其他参数不存在相关性。因此检测精子 DFI 可以在一定程度预测受检者的年龄、精液中的精子活力和精子形态等情况。研究表明，随着男性年龄的增大，会导致精液质量下降，精子活力降低以及正常形态精子比例减少[11-12]，这与本研究的结果一致。而辜秀丽等[13]研究表明精子DFI 与精子活力（r=-0.406，P＜0.001）显著相关，DFI 影响精子活力，与本研究结果“精子DFI 与精子活力（r=-0.365，P＜0.001）具有相关性”一致。此外，本研究中DFI 与精子浓度却没有明显相关性，但随着DFI 水平的增加，精子浓度有下降的趋势，这可能与样本选择有关。DFI 影响精子活力与精子形态的机制可能是因为高龄患者精子DNA 损伤程度越高，为精子运动提供能量的线粒体功能缺陷越严重，导致精子运动能力下降，同时也会诱导精子细胞发生凋亡，引起精子形态结构的改变[14]。这在Xu S 等[15]研究中有类似报道，男性年龄在40 岁以后精子总活力和精液参数则开始下降。在另外一篇文献中也报道DFI≥25%组男性精子总活力、正常精子形态率明显低于DFI＜25%组，受精率、可移植胚胎率、优胚率、妊娠率均劣于对照组，而流产率高于对照组[16]。其他也有类似报道显示DFI＞30%的男性配偶受精率不显著低于DFI≤30%的男性配偶，但其囊胚发育不良的风险会更高[17]。这表明高DFI 指数不仅明显降低精子活力和正常精子形态，而且导致不动精子占比增加，继而影响男性配偶受精率，还可能导致囊胚发育不良，男性的生育能力明显下降。

综上所述，男性高龄对精子参数有显著影响，因此高龄男性在生育前应该进行全面的精液质量分析，充分评估男性生育能力，才能更有利于患者治疗。在今后的研究中还将探讨精子DNA 损伤对辅助生殖技术后生育结局的影响，进一步探索精子DFI 在男性不育中的临床应用价值。