＊王晶 刘桂艳 杨玉延 蔡晓月 杨若熙 王贝

（武汉华夏理工学院 湖北 430200）

沙棘富含维生素C，被称“天然维生素的宝库”，是一种典型的药食同源植物。维生素C又名抗坏血酸，抗氧化功能较强[1]，可提高人体免疫力和抵抗力等。沙棘蕴藏的开发价值高达数百亿，但相关定性和定量研究较少，导致其相关深产品研发滞后。

测定果蔬中抗坏血酸含量的方法多样，如滴定分析法、分光光度法、电化学方法、色谱分析法等，各种方法的适用性不同[2]。总抗坏血酸包括脱氢型抗坏血酸、还原型抗坏血酸及二酮古龙糖酸。经活性炭氧化，样品中还原型抗坏血酸转为脱氢抗坏血酸，与2,4-二硝基苯肼作用生成红色脎，且脎在溶液中的含量与总抗坏血酸含量成正比。沙棘果肉颜色随VC含量变高而加深，要测量其VC含量需掌握高精密度及高准确度的测定方法。本试验利用2,4-二硝基苯肼作为显色剂，分光光度法测定其最大吸收波长下的吸光度，将各种测定方法进行对比，并通过改进活性炭含量吸附沙棘果浆中的橘黄色，可定量探索样品中VC含量[3]，进而提升沙棘利用率、转化率和商品率，为后续产业发展提供技术支撑。

1.材料与方法

(1)仪器与试剂

沙棘果，某鲜品专营店；抗坏血酸，2,4-二硝基苯肼、硫脲、硫酸，均为国药集团化学试剂有限公司；草酸，天津市化工三厂有限公司。FA214型电子天平，上海海康电子仪器厂；TU-1900紫外可见光分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；HH-2数显恒温水浴锅，金坛市杰瑞尔电器有限公司。

(2)试剂配制

称取2g 2,4-二硝基苯肼，溶于100mL 4.5mol/L H2SO4，过滤得2% 2,4-二硝基苯肼溶液。存放于冰箱，用前过滤；在1000mL 1mol/L盐酸中加入100g活性炭，回流3h后过滤，除去滤液中的无铁离子（Fe3+）（亚铁氰化钾试剂检验）。烘箱（110℃）烘干，得无铁离子活性炭；称取0.1g抗坏血酸，溶于100mL蒸馏水得1mg/mL VC水溶液；称取10g硫脲，溶于1000mL蒸馏水得1%硫脲溶液；称取20g草酸，溶于700mL蒸馏水，加蒸馏水定容至1000mL，得2%草酸溶液；量取500mL 2%草酸溶液，加蒸馏水定容至1000mL，得1%草酸溶液；量取70mL硫酸，缓缓注入20mL水中，不断搅拌，冷却后稀释至100mL，得85%硫酸溶液。

(3)样品制备

将新鲜沙棘果洗净擦干，称取5g放入研钵中，加等体积2%草酸，研成匀浆状。将匀浆转移至50mL容量瓶，用1%草酸稀释至刻度，充分摇匀。现用现配。

(4)氧化液制备

在50mL VC标准溶液中加入1.2g活性炭，摇动1min后过滤。再将50mL滤液、5.0g硫脲加入500mL容量瓶，用1%草酸溶液稀释至刻度。

(5)标准浓度溶液制备

取10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL稀释液，分别放入7个100mL容量瓶，用1%硫脲溶液稀释至刻度，使稀释液中VC浓度分别为10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL、70μg/mL[4]。

2.试验方法

(1)最大吸收波长的测定

按照正交实验获得的最优反应条件制备抗坏血酸标准溶液。以未添加抗坏血酸标准溶液组为对照组，在紫外分光光度计设定400～800nm处检测，确定待检测溶液的最大吸收波长。

(2)标准曲线的绘制

制备标准浓度溶液，在最大吸收波长、最优实验条件下分别测定标准浓度的最大吸光度值。以抗坏血酸标准品浓度（C，μg/mL）为横坐标，以吸光度（A）为纵坐标，根据测得吸光度值绘制标准曲线。

(3)四项单因素实验

本实验选取4个主要干扰因素分别开展单因素实验。在其他主要干扰因素值固定不变条件下，分别探究活性炭用量（1g、1.2g、1.5g），温度（37℃、38℃、39℃），水浴时间（3h、3.5h、4h），氧化液用量（4mL、5mL、6mL）对抗坏血酸含量测定值的影响，以测量所得吸光度为主要评价指标来筛选各主要干扰反应因素的最优反应条件。

(4)正交实验

根据上述单因素实验所得结论，以获取抗坏血酸含量测定的最优反应条件组合为正交实验的重要考察指标，选择活性炭用量（A），温度（B），水浴时间（C），氧化液用量（D）四个因素作为考察因素，采用四因素正交实验表的正交实验方法进行样品正交实验。

(5)2,4-二硝基苯肼法

制备样品溶液，按最优实验条件实验，以不添加抗坏血酸溶液为对照组，在396nm处测定其吸光度，将结果带入绘制的标准曲线中计算VC含量。

精密性实验：用2,4-二硝基苯肼法对溶液进行VC含量测定，连续多次测定吸光度值，计算沙棘果中VC含量，计算测定的相对标准偏差。

稳定性实验：用2,4-二硝基苯肼法对溶液进行VC含量测定，每隔20min检测其吸光度，检测时间（min）对于吸光度的影响。

加标回收实验：量取相同体积样品溶液，分别加入80%、100%、120%质量分数的抗坏血酸，用2,4-二硝基苯肼法测定吸光度，重复三次实验操作，计算求得其加标回收率。

3.试验结果与讨论

(1)单因素实验结果分析

①活性炭用量的影响

活性炭作为实验中的氧化剂，将还原性抗坏血酸氧化为脱氢抗坏血酸。活性炭用量（g）对吸光度（A）的影响，见图1。可知，在恒定温度、水浴时间和氧化液用量条件下，活性炭用量不足时，无法完全氧化抗坏血酸，吸光度较不明显；当活性炭含量达1.2g，对抗坏血酸的氧化达到完全，吸光度显著且趋于稳定。故选1.2g活性炭为实验测定条件。

图1 活性炭用量的影响

②温度的影响

作为影响脱氢抗坏血酸与2,4-二硝基苯肼反应速度的重要因素，温度（℃）对吸光度（A）具有显著影响，见图2。温度较低时，反应速度慢，吸光度测定值较低；温度上升，吸光度随之显著上升，在38℃以上趋于平稳。故选38℃为实验测定条件。

图2 温度的影响

③水浴时间的影响

水浴时间直接影响脱氢抗坏血酸与2,4-二硝基苯肼反应程度。本实验中水浴时间（h）对吸光度（A）影响见图3。水浴时间不足，脱氢抗坏血酸不能与2,4-二硝基苯肼完全反应生成脎，导致吸光度较低；水浴时间足够时反应完全，吸光度值不会随时间增加而上升，在3.5h后趋于稳定。故选3.5h为实验测定条件。

图3 水浴时间的影响

④氧化液用量的影响

氧化液用量是影响脎生成的重要因素，吸光度值会随其增加而增高。若用量不够，不仅浪费显色剂，且不足以形成足够的脎用于吸光度的测定。见图4。氧化液用量＜4mL，吸光度值较小；氧化液用量＞5mL，吸光度值基本不变。同时考虑比色皿容量大小，故选5mL氧化液用量为实验测定条件。

图4 氧化液用量的影响

(2)正交实验结果分析

正交实验因素的极差值越大，则该因素的水平变化对实验测得吸光度值影响越大。如表1所示，四因素对沙棘果中VC含量测定影响的顺序为：活性炭用量（A）＞水浴时间（C）＞氧化液用量（D）＞温度（B）。

表1 正交实验结果

据实验，最优反应条件为A2，B2，C2，D2，即1.2g活性炭，38℃温度，3.5h水浴时间，5mL氧化液用量。

如表2所示，四因素对沙棘果中VC含量测定的影响只有活性炭用量有显著性差异。

表2 正交实验方差分析结果

表3 加标回收率实验

(3)方法验证结果

①最大吸收波长与线性关系

在其他水平恒定不变的情况下，加入抗坏血酸标准溶液得可见光吸收曲线。经实验观察，最大吸收波长为496nm，故选496nm进行测定。

线性范围评价是测定被测物质浓度或活性的反应曲线接近直线的程度。如图5，以抗坏血酸标准品溶液浓度为横坐标，以溶液吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，得含抗坏血酸标准品溶液的线性回归方程为y=0.0114x+0.0764，r2=0.9984，且抗坏血酸浓度在10～70μg/mL浓度范围内具有良好的线性关系。

图5 标准浓度抗坏血酸线性关系

②精密度

相对标准偏差（RSD）表示精密度，其可接受范围一般为2.0%以下。2,4-二硝基苯肼法测定VC含量精密度的相对标准偏差为0.63%，精密度较好。

③稳定性

2,4-二硝基苯肼法测定VC含量有较好稳定性，但若实验时间较长，生成的脎会分解，溶液吸光度会随时间增加呈现细微下降趋势。故须在溶液配制后立即检测。

④加标回收率

2,4-二硝基苯肼法测定VC含量平均加标回收率为102.1%±0.1%，在回收率限度范围内。说明分析方法对分析物在纯溶液或复杂的基制检测环境中反应能力一致性较强，受基质影响较小。

4.总结与展望

2,4-二硝基苯肼法测定沙棘果中VC含量，其基本原理为氧化生成的脱氢抗坏血酸与显色剂作用生成红色化合物，利用分光光度计进行比色、标准曲线计算样品中VC含量。本实验以2,4-二硝基苯肼作为显色剂，活性炭作为氧化剂，活性炭1.2g，温度38℃，水浴时间3h，氧化液5mL组合测定。精密度高，稳定性强，回收率好，易于推广，为准确测定沙棘果中VC含量提供依据，可推动高附加值沙棘产品研发，市场前景广阔。显然，沙棘中存在大量较强抗氧化性的多酚，目前该方法没有色谱分离，无法严密考虑多酚引起的显色反应干扰实验结果。接下来将继续实验，经色谱分离后观察多酚引起的抗氧化性与维生素C的对比，进一步优化实验数据。