李 辉

(衡水学院湿地保护与研究中心，河北 衡水 053000)

衡水湖坐落于河北省衡水地区境内，位于京津冀的生态敏感地带，在防涝防旱、调节气候、维护环境生态安全和保护生物多样性等方面发挥着重要的作用[1]。同时，衡水湖是华北内陆地区唯一保持水域、沼泽、滩涂、草甸和林地等完整的内陆湿地生态系统，现有湖泊面积75km2，蓄水能力达到1.88亿m3[2]。衡水湖是联结印度洋、南亚大陆、东亚和西伯利亚生物多样性的中心点，是北温带野生动物的聚集地，其独特的水文、土壤和气候孕育了复杂且完善的动植物群落，衡水湖位于“东亚-澳大利西亚”迁徙路线的中心部位，是数百万只候鸟重要的停歇地、中转站和密集交汇区[3]。衡水湖蕴藏着巨大的生态效益、社会效益、经济效益[4]。

微生物参与湿地生态系统的物质循环和能量流动，是湿地生态系统的重要组成成分[5]。微生物的代谢不仅改变湿地土壤的理化性质，而且能够在降解有机质，产生和传递能量，促进地球元素循环等方面起着非常重要的作用[6]。湿地微生物多样性的高低直接决定着湿地生态系统的稳定性[7]。近年来，国内对天然湿地土壤微生物的研究较多，而对人工湿地，尤其是针对衡水湖国家级自然保护区有关微生物多样性的研究几乎没有。本文选取衡水湖湿地国家自然保护区中荷花公园区域的土壤为研究对象，采集不同位点的土样，采用高通量测序的研究方法，通过对湿地土壤细菌群落多样性进行分析，旨在揭示衡水湖湿地荷花公园区域土壤细菌群落的多样性，为今后衡水湖湿地土壤微生物的合理开发和利用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

于2020年10月围绕衡水湖湿地荷花公园选取5个采样点，在各个采样点分别采集表层0～5cm和5～10cm的土样，每个采样点取4个平行样并混合均匀，将混合均匀的样品装入灭过菌的自封袋内并尽快运回实验室，置于-80℃冰箱保存。

1.2 衡水湖湿地荷花公园土壤微生物组成多样性测序

采用FastDNA® Spin Kit for Soil(MP Biomedicals 美国)总DNA提取试剂盒，对采集的样品进行总DNA提取。利用PCR扩增细菌古菌16S rRNA基因V3-V4区域，扩增引物 338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)；PCR扩增体系95℃ 3min；95℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 45s，30次循环；72℃ 10min。高通量测序由上海美吉生物医药科技有限公司在Miseq PE300/NovaSeq PE 250平台进行测序完成。所得的测序数据通过Excel和R语言以及美吉云平台进行统计分析和绘图。

2 结果与分析

2.1 衡水湖湿地荷花公园5个土壤样品的物种分类学分析

本研究共5个样品，对其细菌16S rRNA基因测序共获得226103对reads，对所得序列进行OTU划分，共得出4359个OTU，再对97%相似水平下的OTU进行生物信息统计分析，5个样品中共得出2个Domain，2个Kingdom，60个Phylum，166个Class，371个Order，623个Family，1105个Genus，1886个Species。由表1可知，5个样品中发现的OUT数分别为1683个、3132个、2171个、2765个和1297个。5个样品中a2和a5发现的物种数较多，分别为1325个和1316个，a3和a1物种数相对少些，分别为1093个和1001个，a7样本中的物种数最少，为866个。由此可见，5个样品土壤中物种分类学上存在明显差异，这说明衡水湖荷花公园土壤的微生物多样性比较高。

表1 不同土壤样品的物种分类学分析

2.2 衡水湖湿地荷花公园5个土壤样品稀释曲线分析Alpha多样性分析

利用MiSeq平台对采集的5个样品进行高通量测序，5个样品的覆盖率均在97%以上，见表2，且每个样品的稀释曲线基本上接近饱和，见图1，表明测序深度基本达到饱和，说明当前测序量下能够真实地反映样品土壤细菌古菌的alpha多样性。由表2可知，a2样品的sobs指数、ace指数、bootstrap指数和chao指数均高于其他4个样品，这表明a2样品土壤中细菌古菌群落丰富；shannon指数值越大，微生物群落多样性越高，simpson指数值越小，微生物群落多样性越高，a2样品shannon指数值最大，simpson指数值最小，pd指数最大，表明该样品土壤中细菌古菌群落多样性高于其他4个样品；shannoneven指数和simpsoneven指数反映微生物群落的均匀度，a2样品和a5样品中细菌古菌群落的均匀度明显高于其他3个样品。

表2 不同土壤样品Alpha多样性分析

图1 不同土壤样品稀释曲线分析

2.3 衡水湖湿地荷花公园5个土壤样品细菌古菌群落heatmap图

将衡水湖湿地荷花公园不同土壤样品进行数据库比对，并分析不同分类水平上的细菌古菌群落结构组成。在门水平上，选取总丰度前50的物种绘制heatmap图，见图2，由图2可知，衡水湖湿地荷花公园土壤中细菌古菌群落结构在门分类水平上具有较高的多样性，不同样品之间细菌古菌组成差异不大，但相对丰度差异很大。优势菌门为变形菌门(Proteobacteria)18%～35%、放线菌门(Actinobacteriota)6%～21%、拟杆菌门(Bacteroidota)3%～18%、绿弯菌门(Chloroflexi)4%～18%、厚壁菌门(Firmicutes)1%～7%、浮霉菌门(Planctomycetota)1%～13%、酸杆菌门(Acidobacteriota)4%～9%、疣微菌门(Verrucomicrobiota)1%～6%、泉古菌门(Crenarchaeota)2%～5%、脱硫杆菌门(Desulfobacterota)1%～7%等[8，9]。在大多数的湿地土壤样品中，变形菌门、放线菌门、拟杆菌门和绿弯菌门等为优势菌门[10]。有研究表明，变形菌门中含有多种反硝化细菌，可进行自养和异样；对土壤中的含氮物质的循环起着主要作用[11，12]。据报道，Chloroflexi种类形态多样，营养方式和代谢途径十分丰富，可存活于多种环境中，并且其多数种类参与了C、N、S等一系列重要元素的生物地球化学循环过程[13]。在a2、a3和a5样品土壤中，Chloroflexi相对丰度在11%～19%以上，而在a1和a7样品土壤中，Chloroflexi相对丰度在4%～6%，造成这种差距的原因，可能是由于a1和a7采样点是近水边裸露的土壤，而a2、a3和a5采样点是水边覆盖着植物残渣的黑色土壤。由此可见，Chloroflexi的物种丰度可能与衡水湖湿地荷花公园的周边环境有关，从而成为衡水湖湿地荷花公园土壤中的第四大优势菌门。有报道称，酸杆菌门是重要的根际细菌[14]。在a2、a3和a5样品土壤中，Acidobacteriota相对丰度在4%～10%，而在a1和a7样品土壤中，Acidobacteriota相对丰度均低于1%，这可能是因为a2、a3和a5采样点均有植被覆盖。

注：横坐标为样本名(或分组名)，纵坐标为物种名，通过色块颜色梯度来展示样本中不同物种的丰度变化情况，图中右侧为颜色梯度代表的数值。

3 结论

本研究共检测出60个门166纲371目623科1105属1886种，共计4359个OUT。由alpha多样性可知，a2样品土壤中细菌古菌群落的丰富度和多样性高于其它4个样品，a2和a5样品土壤中细菌古菌群落的均匀度明显高于其它3个样品。衡水湖湿地荷花公园土壤中细菌古菌群落结构在门水平上相差不大，但物种相对丰度差异大。衡水湖湿地荷花公园土壤的优势菌门为变形菌门(Proteobacteria)18%～35%、放线菌门(Actinobacteriota)6%～21%、拟杆菌门(Bacteroidota)3%～18%、绿弯菌门(Chloroflexi)4%～18%等。