闫学花,陈文楠,朱雅婷,刘小华,师娟子

(1.西北妇女儿童医院生殖中心,陕西 西安 710003;2.陕西省妇科疾病临床研究中心,陕西 西安 710003)

卵胞浆内单精子注射技术(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)已成为一种越来越普遍的辅助生殖技术,适用于少精症、弱精子症和畸胎症[1]。尽管可以达到约70%受精率,但仍然存在1%～5%的完全受精失败,ICSI后完全受精失败主要归因于卵母细胞活化不足。有研究报道,卵子激活技术能够改善明确精子相关的卵母细胞活化不足的夫妇临床结局[2-4],同时卵子激活剂A23187能够提高冻融睾丸精子的ICSI效率[5-6]。本文利用真实世界的临床数据,采用倾向评分匹配(propensity score matching,PSM)的方法来减少偏倚,通过比较卵子激活剂A23187诱导的卵子激活术( artificial oocyte activation,AOA)对新鲜睾丸精子ICSI后的胚胎发育和临床结局的影响,旨在为AOA的临床应用提供进一步的依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2014年1月至2020年4月期间在西北妇女儿童医院生殖中心睾丸取精术(testicular sperm aspiration,TESA)后行ICSI的374对不孕夫妇作为研究对象,按照ICSI后是否采用卵子激活剂A23187行人工卵子激活术随机分为卵子激活组(n=47)和常规对照组(n=327),所有参与者均为第二周期及多周期患者。纳入的所有研究对象均知情同意自愿参与治疗,本研究经西北妇女儿童医院生殖医学伦理委员会批准(审批编号:2022007)。

1.2 促排卵方案

所有患者均采用拮抗剂方案(拮抗剂高、中、低方案)、激动剂方案(长方案、超长方案、短方案和超短方案)和其他方案(自然周期、黄体期促排卵子方案、微刺激方案和安宫周期),所有患者在促排卵8～14d后,当≥2个卵泡直径≥18mm,或者3个卵泡直径≥17mm时皮下注射重组人绒毛膜促性腺激素(艾泽,默克雪兰诺,英国)250μg或注射用人绒毛膜促性腺激素 (human chorionic gonadotrophin,HCG,珠海丽珠制药)5000～1000U扳机。扳机后,32～36h经阴道超声下取卵,取出后,将卵冠丘复合体迅速放入培养液,38～40h后选取成熟卵子(metaphase Ⅱ,MⅡ)行ICSI。

1.3 睾丸精子的获得及卵子激活

患者于局部麻醉的状态下行TESA术,绷紧阴囊皮肤,采用睾丸穿刺针垂直扎入阴囊皮肤,利用负压抽取少量睾丸组织并放入培养液中,在显微镜下用1mL注射器划破睾丸组织,观察是否达ICSI标准,达标后将睾丸精子加入盘中备ICSI用。

ICSI后,将存活的卵子用巴士吸管立即转移到预平衡好的30μL即用型卵子激活剂 (GM508 CultActive,Ca2+Ionophor A23187,德国 Gynemed公司)的培养滴中,孵育15min后用培养液G-1充分洗涤2～3遍后放入新的G-1液滴中,置于37℃、6%二氧化碳培养箱中进行后续培养。

1.4 受精判断、胚胎培养及评级

ICSI后18～19h观察卵胞浆出现双原核(2PN)为正常受精,其余为异常受精或者未受精。在胚胎培养第3天选择1～2个胚胎进行移植,或继续培养至第5天进行囊胚移植,或冷冻保存后行冷冻胚胎或冷冻囊胚移植。

卵裂期胚胎评价为多个参数的综合评价,主要参数为第3天胚胎卵裂球数目、碎片体积比例和不均卵裂球数目,我中心将2.5级以上胚胎定义为优质胚胎,其他级别为可用胚胎。在本实验中我们根据评级将患者分为3组(优:1个或者2个优质胚胎;中:1个优质胚胎和1个可用胚胎;差:1个或者2个可用胚胎)。

囊胚期胚胎评价采用Garnder囊胚分级法。≥3BB定义为优质囊胚,其余为可用囊胚。同样分为3组,即优:≥3BB;中:1个优质囊胚+1个可用囊胚或者3CB、4CB、5CB、6CB、3BC、4BC、5BC、6BC;差:2BB、2BC、2CB、2CC、3CC、4CC、5CC、6CC、早期囊胚。

1.5 观察指标

受精率:2PN数/MⅡ卵子数;可用胚胎率:可用胚胎数/MⅡ卵子数;优胚率:优质胚胎数/MⅡ卵子数;可用囊胚形成率:囊胚形成数/囊胚培养数,囊胚形成数=移植的囊胚数+冷冻的囊胚数;妊娠率:临床妊娠率=超声可见孕囊及原始心管搏动/移植周期数×100%。妊娠判断:临床妊娠为孕5周B超下可见孕囊及胎心搏动[7]。

1.6 倾向评分匹配

为了避免两组患者基线之间的差异而造成偏倚,用倾向评分匹配使得两组的基线特征更加接近平衡。本研究采用1∶3比例进行匹配,匹配的相差范围为0.01,匹配的条件为女方年龄、促排卵方案、移植的胚胎类型、胚胎质量、胚胎数量。共46个卵子激活组患者匹配到134个对照组人群(其中44个卵子激活组各匹配到3个对照组,2个卵子激活组各匹配到1个对照组),1个激活组患者没有匹配到对照组。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 匹配前后两组患者的一般资料比较

匹配前,卵子激活组女方年龄较小,成熟卵子数较多,差异有统计学意义(t值分别为2.72、-2.56,P<0.05),其他资料无统计学差异(P>0.05);匹配后,两组间基线资料比较均无显著性差异(P>0.05),具有可比性,见表1。

表1 两组的基线特征比较

指标匹配前卵子激活组(n=47)对照组(n=327)χ2/tP匹配后卵子激活组(n=46)对照组(n=134)χ2/tP移植胚胎质量0.280.871.030.98 优22(46.81)140(42.81)21(45.65)61(45.52) 中9(19.15)65(19.88)9(19.57)28(20.90) 差16(34.04)122(37.31)16(34.78)45(33.58)移植胚胎类型1.790.180.320.44 胚胎35(74.47)270(82.57)35(76.09)109(81.34) 囊胚12(25.53)57(17.43)11(23.91)25(18.66)移植胚胎数1.520.471.450.66 116(34.04)93(28.44)15(32.61)39(29.10) 231(65.96)227(69.42)31(67.39)95(70.90)妊娠率29(61.70)181(55.35)-0.820.4129(63.04)77(57.46)0.640.51

2.2 两组的实验室和临床结果比较

匹配前,两组间在受精率、优质胚胎率、可用胚胎率和囊胚形成率之间无显著性差异(P>0.05);匹配后,卵子激活组的可用胚胎率低于对照组(χ2=47.68,P<0.05),其余指标差别无统计学意义(P>0.05),见表2。

表2 两组的实验室和临床结果比较 [n,n (%)]

2.3 多因素Logistic回归分析卵子激活与临床妊娠的关系

采用Logistic回归模型评估卵子激活处理对临床妊娠率的独立作用,结果发现匹配后未调整模型、调整模型均无统计学差异,其OR值及95%CI分别为1.26(0.63～2.52)、1.55(0.67～3.56),P>0.05,见表3。

表3 多因素 Logistic回归分析卵子激活与临床妊娠的关系

3 讨论

ICSI是挑选单个精子注射入卵母细胞完成受精的过程,对于男性不育的患者,包括少弱畸精子症及梗阻性无精子症,以及不明原因一代受精失败的患者能够得到与常规受精相同的临床结局[1]。ICSI不仅可以使用射出精子,还可以利用睾丸中的精子完成受精。但是,与射出精子相比,睾丸精子的精子活力和精子成熟度存在不同程度的降低[2]。

3.1 人工卵子激活术对ICSI助孕临床结局的影响

卵子激活是受精过程的关键步骤之一,是受精和胚胎发育的先决条件[3]。AOA能有效改善受精失败或受精率低[8-12]及胚胎发育不良[13]的不孕夫妇的临床结局,还可以显著提高试管效率[5],提高每移植胚胎的活产率[14]。近年来关于人工卵子激活与临床结局的研究很多,但是结果一直存在争议。先前样本量为21到194组患者的研究表明,人工卵子激活对临床妊娠结局没有影响[3,10,15-17]。而另有一些研究表明AOA可能对有精子相关的卵母细胞活化不足的不孕夫妇有帮助[9,11],我们的研究结果与O’Neill等[16]结果一致。我们发现与对照组(TESA+ICSI组)相比,TESA+ICSI+AOA组具有相同的临床妊娠机会,这对于我们的临床咨询有一定的指导意义。

3.2 卵子激活术与实验室结局的关系

本研究总共分析了374对夫妇采用睾丸取精术后行ICSI,其中47对夫妇实施了AOA,327对夫妇实施常规TESA+ICSI,并对两组的受精数(率)、可用胚胎数(率)、优质胚胎数(率)及囊胚形成数(率)进行对比,发现匹配后卵子激活组的可用胚胎率显著低于对照组,但对受精率是没有改善的,说明卵子激活术对于新鲜睾丸精子ICSI后的受精率是没有作用的。匹配后多因素回归结果显示AOA并不能改善患者的临床妊娠结局。Bonte等[14]研究表明,AOA只是对有精子相关的卵母细胞活化不足的患者有效,而我们目前临床上没有开展这方面的诊断,只是对前次受精率低,或者胚胎发育差的这类患者进行卵子激活,但有可能这些人群并不是有卵子激活障碍的人群,可能并没有达到真正的“对症”治疗,所以对受精的改善不明显。

3.3 研究对象的选择优势

本次研究排除了所有一周期的患者,只纳入了二周期及多周期的患者作为实验组(卵子激活组)和对照组(常规TESA+ICSI组)。这是考虑临床上AOA的治疗原则:AOA组的患者都是多周期的,这样设计比较严谨。同时,我们使用MⅡ卵母细胞的数量作为协变量,而不是收集的所有卵母细胞数量,因在ICSI周期中,成熟的卵母细胞数量是ICSI成功的关键因素,而不是获得的卵母细胞数量。

尽管卵子激活在临床上的应用越来越广泛,但在其应用的适应证方面还需要进一步细化,或者未来能够开展相关的诊断,使其能够真正的“对症”治疗。卵子激活作为一项试验性技术,仍然存在很多未知性,需要更加深入的观察和多中心的大样本研究。