张 晴,李 旭,高长俊,任 蓉,韩 静

(唐山市妇幼保健院小儿血液科,河北 唐山 063000)

免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia,ITP)为儿童时期最常见的自身免疫出血性疾病,亦称特发性血小板减少性紫癜,可见皮肤或黏膜出血点、瘀点、瘀斑、束臂试验阳性、血小板计数(platelet count,PLT)减少、出血时间延长、骨髓象典型表现等[1]。但在对ITP患儿的临床诊治中,部分家长容易因顾虑较多(如患儿年龄较小、具有创伤性等)而无法配合骨髓穿刺术检查。近年来,随着分子生物学、医学免疫学等不断发展,越来越多的研究发现血小板抗原产生特异性抗体为ITP发病的重要原因之一[2-4],其中又以血小板膜糖蛋白(platelet membrane glycoprotein,GP)特异性抗体最为常见。GP特异性抗体异常升高可增加血小板对网状内皮系统的破坏而促进病情进展,但目前临床关于GP特异性抗体(抗GPⅠb/Ⅸ抗体、抗GPⅡb/Ⅲa抗体)对ITP患儿疗效、预后等的影响尚无统一定论。故开展本研究,旨在进一步分析GP特异性抗体在ITP患儿中的表达情况及其与疗效、出血程度的关系,为ITP临床诊治提供参考,现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年2月至2020年12月于唐山市妇幼保健院儿科就诊的102例ITP患儿为研究对象,并将其纳入病例组,另选取同期同院进行体检的110例健康儿童纳入健康组。纳入标准:①病例组患儿诊断符合中华医学会儿科学分会血液学组关于《儿童原发性免疫性血小板减少症诊疗建议》中的相关标准[5];②初诊者;③无其他免疫系统疾病、造血系统疾病者;④完成各项检测,诊断明确,且均接受糖皮质激素冲击疗法治疗者等。排除标准:①有免疫抑制剂治疗史,或治疗期间接受其他治疗者;②合并恶性肿瘤、肝肾器官功能障碍者;③合并先天性心脏病、唐氏综合征、地中海贫血等疾病者;④其他继发性的血小板减少症者等。脱落与剔除标准:①治疗、检查依从性差者;②治疗期间死亡者。

健康组:男62例,女48例;居住地:城市69例,农村41例;年龄1～8岁,平均(4.63±1.20)岁。病例组:男55例,女47例;居住地:城市64例,农村38例;年龄1～7岁,平均(4.19±1.05)岁。两组一般资料比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。本研究获唐山市妇幼保健院医学伦理委员会审批(伦理批号:2018-LY-B012),ITP患儿与健康儿童家属均知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 治疗方法

病例组患儿均接受糖皮质激素冲击疗法,即予以地塞米松磷酸钠注射液(1mL:2mg,国药准字H61020227,陕西博森生物制药股份集团有限公司)治疗,0.6mg·kg-1·d-1,连用4d,以4周为1个疗程,共治疗5个疗程,并随访3个月。

1.2.2 GP特异性抗体检测方法

①标本采集:采集两组入院后的空腹外周血5mL,予以EDTA抗凝处理后,离心(离心半径10cm,3 500r/min,离心15min),分离血浆后置于-80℃冰箱保存待测;②改良单克隆抗体血小板抗原固定试验检测GP特异性抗体,主要操作包括:取正常人O型血小板悬液调整密度(调整后:1×109/L)后移至离心管(EP管,100uL/管),然后加入待测血浆(100uL),混匀后室温孵育(60min);③加磷酸盐(phosphate buffered saline,PBS)/EDTA缓冲液(0.6mL)洗涤3次(3 000g离心,2min/次,弃去上清),每管加入血小板裂解液(100uL)进行震荡、使其混匀,然后进行冰箱孵育(4℃,30min),再做离心处理(26 000g,离心30min);④稀释上清液(1∶5)后加样(每孔100uL)至俘获单抗的羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG)包被的酶标板上,设双复孔,进行室温振荡孵育(60 min);⑤以PBS/吐温(Tween)(0.01 mol/L)洗涤4次,每孔加入碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG(100uL),封膜、室温振荡孵育(60min);⑥再用PBS/Tween(0.01 mol/L)洗涤6次,加入对硝基苯磷酸盐底物缓冲液(100uL),水浴箱孵育至显色(37℃,2～3h);⑦采用酶标仪(MR-96 A型,深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)测定吸光度(A)值(主要为405nm、490nm处),每板设4个正常对照,用A405nm减A490nm,若A值大于正常A值的均数+3倍标准差视为阳性[6]。

1.3 观察指标

1.3.1 两组GP特异性抗体表达情况

根据1.2.2检测结果记录两组抗GPⅠb/Ⅸ抗体、抗GPⅡb/Ⅲa抗体表达水平。

1.3.2 出血部位及不同GP特异性抗体出血程度

记录ITP患儿出血部位,根据1.2.2检测结果记录ITP患儿抗GPⅠb/Ⅸ抗体阳性、抗GPⅡb/Ⅲa抗体阳性、双抗体阳性、双抗体阴性情况,同时分析不同GP特异性抗体表达下的出血程度,ITP出血分级标准见表1[7]。

表1 ITP出血分级标准

1.3.3 不同GP特异性抗体疗效

治疗5个疗程后检测并比较不同GP特异性抗体(抗GPⅠb/Ⅸ抗体阳性、抗GPⅡb/Ⅲa抗体阳性、双抗体阳性、双抗体阴性)表达下的疗效,检测方法同1.2.2,根据《美国血液学会免疫性血小板减少症基于证据的实践指南(儿童)》评估患儿疗效[8],PLT≥30×109/L且为治疗前的2倍以上(相隔7d以上测定2次),亦无出血症状为有效;PLT<30×109/L(必须相隔1d以上测定2次)或为治疗前的2倍以下,和/或有出血症状为无效。

1.3.4 不同GP特异性抗体预后

随访3个月后检测并比较不同GP特异性抗体(抗GPⅠb/Ⅸ抗体阳性、抗GPⅡb/Ⅲa抗体阳性、双抗体阳性、双抗体阴性)表达下的预后,检测方法同1.2.2,随访3个月后PLT≥100×109/L为完全缓解,随访3个月后PLT<100×109/L为未完全缓解。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 两组GP特异性抗体表达情况比较

病例组抗GPⅠb/Ⅸ抗体、抗GPⅡb/Ⅲa抗体表达水平高于健康组,差异有统计学意义(t值分别为16.521、51.718,P<0.05),见表2。

表2 两组GP特异性抗体表达情况比较

2.2 ITP患儿出血部位及不同GP特异性抗体出血程度比较

102例ITP患儿抗GPⅠb/Ⅸ抗体阳性、抗GPⅡb/Ⅲa抗体阳性、双抗体阳性、双抗体阴性检出率分别为15.69%(16/102)、4.90%(5/102)、30.39%(31/102)、49.02%(50/102),0级、1级、2级出血率分别为16.67%、50.00%、33.33%,口腔、皮肤、鼻、胃肠道出血各22、18、26、19例,无月经、泌尿系、颅内、结膜出血;且0级出血以双抗体阳性占比(0)最低,1级出血以抗GPⅡb/Ⅲa抗体阳性占比(80.00%)最高,2级出血以抗GPⅠb/Ⅸ抗体阳性、双抗体阳性占比(62.50%、48.39%)较高,差异有统计学意义(H=38.237,P<0.05),见表3。

表3 不同GP特异性抗体出血程度比较 [n(%)]

2.3 不同GP特异性抗体疗效比较

102例ITP患儿治疗5个疗程后有效率为78.43%;双抗体阴性ITP患儿有效率为96.00%,高于抗GPⅠb/Ⅸ抗体阳性、抗GPⅡb/Ⅲa抗体阳性、双抗体阳性ITP患儿的50.00%、60.00%、67.74%,差异有统计学意义(χ2=19.866,P<0.05),见表4。

表4 不同GP特异性抗体疗效比较 [n(%)]

2.4 不同GP特异性抗体预后比较

102例ITP患儿随访3个月后完全缓解率为68.63%;双抗体阴性ITP患儿完全缓解率为92.00%,高于抗GPⅠb/Ⅸ抗体阳性、抗GPⅡb/Ⅲa抗体阳性、双抗体阳性ITP患儿的31.25%、40.00%、54.84%,差异有统计学意义(χ2=27.709,P<0.05),见表5。

表5 不同GP特异性抗体预后比较 [n(%)]

3 讨论

3.1 ITP患儿的发病机制与其研究现状

ITP为儿童常见良性出血性疾病,可致皮肤黏膜自发性出血、血小板减少、凝血功能障碍等,其中颅内出血是引起患儿死亡的重要原因。同时,该病发病机制复杂,随着近年来对ITP发病机制的相关研究不断深入,越来越多的学者认为,GP特异性抗体介导的血小板破坏是ITP的经典发病机制,能够有效区别非免疫性血小板减少及免疫性血小板减少,具有特异性高、阳性预测值较高等特点,且不同GP特异性抗体作用的强度、持续时间等均存在明显差异[9]。但目前国内关于GP特异性抗体的报道多集中于成人ITP表达情况的分析,关于ITP患儿的相关报道较少。因此,分析GP特异性抗体在ITP患儿中的表达情况及其与疗效、出血程度的关系对ITP患儿治疗方案的选择及疾病预后的改善意义重大。

3.2 ITP患儿GP特异性抗体表达及不同GP特异性抗体出血程度

既往研究发现,ITP患者出血程度不尽相同,且大多患者临床出血程度与PLT呈反比,即PLT越低、出血症状越严重;PLT越高、出血症状越轻,但某些PLT者临床并无出血症状或仅伴有轻度出血,不同个体间存在差异[10-11]。本研究结果显示,病例组抗GPⅠb/Ⅸ抗体、抗GPⅡb/Ⅲa抗体表达水平高于健康组,且0级出血以双抗体阳性占比最低,1级出血以抗GPⅡb/Ⅲa抗体阳性占比最高,2级出血以抗GPⅠb/Ⅸ抗体阳性、双抗体阳性占比较高,提示ITP患儿GP特异性抗体表达较高,且不同GP特异性抗体出血程度存在差异。分析原因可能为抗GPⅠb/Ⅸ抗体、抗GPⅡb/Ⅲa抗体不仅可直接对ITP患儿的血小板产生作用,亦可结合机体中的血小板抗原形成复合物,进而影响ITP患儿血液纤维程度,参与血小板的黏附、聚集;同时,抗GPⅠb/Ⅸ抗体是血小板血管性血友病因子的重要受体,可发挥降低ITP患儿血小板黏附的作用,进而阻止血管损伤部位血小板黏附、聚集,加重患儿出血症状,使得抗GPⅠb/Ⅸ抗体阳性、双抗体阳性患儿2级出血占比较高,进一步促进患儿病情进展[12-15]。因此,临床可通过监测GP特异性抗体表达水平来预测其病情进展情况。

3.3 不同GP特异性抗体疗效与预后

糖皮质激素是ITP患儿的一线治疗药物之一,可通过抑制自身抗体产生、封闭网状内皮系统免疫球蛋白Fc部分c末端的受体(Fc受体)等,减少血小板的破坏而产生治疗效果[16-17]。本研究结果显示,102例ITP患儿治疗5个疗程后有效率为78.43%、随访3个月后完全缓解率为68.63%,且双抗体阴性ITP患儿有效率、完全缓解率较高,而其余各组比较差异无统计意义,进一步说明GP特异性抗体阴性ITP患儿疗效、预后较好,而抗GPⅠb/Ⅸ抗体阳性、抗GPⅡb/Ⅲa抗体阳性、双抗体阳性ITP患儿对一线治疗的反应较差,可致治疗无效、预后不良等,临床可根据患儿病情予以个体化治疗。考虑原因可能为ITP患儿的发生与自身GPⅠb、GPⅡb抗原的免疫失耐受密切相关,主要包括中枢免疫失耐受和外周免疫失耐受等更高层次上的免疫耐受机制紊乱,使得糖皮质激素难以控制病情进展;同时,GPⅠb属于Leucine丰富家族蛋白,抗GPⅠb/Ⅸ抗体、抗GPⅡb/Ⅲa抗体表达水平升高可能提示ITP患儿出现感染,而糖皮质激素的使用有助于病原菌的生长,刺激抗GPⅠb/Ⅸ抗体、抗GPⅡb/Ⅲa抗体产生,形成恶性循环而使糖皮质激素治疗失败[18-20]。其中,抗GPⅠb/Ⅸ抗体、抗GPⅡb/Ⅲa抗体是传导血小板聚集信号的关键环节,可通过不同途径(主要为Fc依赖途径、Fc非依赖途径)清除血小板促进病情进展[21],临床可通过以上靶点研发新的药物对ITP患儿进行治疗。

综上,ITP患儿抗GPⅠb/Ⅸ抗体、抗GPⅡb/Ⅲa抗体表达水平较高,且其不同表达水平与患儿出血程度、疗效及预后均有密切关系,临床可通过监测GP特异性抗体来对ITP患儿进行早期诊断,并对其出血程度、疗效、预后等进行预测。但本研究亦存在一定的不足,如样本量较少、观察时间短、纳入病例单一等,可能导致结果存在一定偏倚,临床可进一步研究以明确GP特异性抗体与ITP患儿病情进展、疗效、预后等的关系。