梁秀美, 夏海涛, 张维一, 林定鹏, 何如意,郭秀珠, 陈官菊, 张 井*,

(1.浙江省亚热带作物研究所，浙江 温州 325005；2.浙江省温州市农业科学研究院，农业农村部农产品质量安全风险评估实验站，浙江 温州 325006；3.温州科技职业学院 (温州市农业科学研究院)/浙南作物育种重点实验室，浙江 温州 325006)

我国是世界第一水产养殖大国，也是世界唯一的养殖产量超过捕捞产量的国家[1]。目前，发达国家和国际组织在水产领域已经建立了较为完善的农药最大残留限量 (MRL) 体系，如日本共制定二甲戊灵、氯氰菊酯、唑草酮和滴滴涕等131 种农药264 项MRL，所涉及的水产品种类包括鲑形目、鲈形目、甲壳纲、其他鱼类和水生动物等；此外，日本还规定标准中未包含、无具体限量且非豁免的农药化学物质统一执行0.01 mg/kg 的限量标准。但我国水产品中农药残留限量设定指标较少，仅5 种农药5 项MRL 标准，且标准中未包含、无具体限量且非豁免的农药未制定统一限量标准，与国外标准相比还存在较大差距[2]。水产养殖底泥是各种污染物的主要储存场所之一，如何最大限度地减少病害发生，对于广大水产养殖户(特别是池塘养殖户) 来说至关重要，清塘是其中的关键环节，但在苗种放养时底泥是否达到养殖要求，清塘药物是否会通过在水产品中残留带来食用风险，目前还未引起广泛重视。虽然《水产养殖用药明白纸2022 年1、2 号》[3]文件中对批准可用的有机磷、菊酯类等清塘杀虫剂的休药期做了明确规定，并明确指出禁止使用林丹等有机氯类农药，但对于酰胺类和三嗪类清塘除草剂、氟虫腈等限制使用的苯基吡唑类清塘杀虫剂并未做明确规定。

水产品中农药残留样品前处理方法主要有固相萃取法[4-6]、分散固相萃取法[7-8]、加速溶剂萃取法[9]、凝胶渗透色谱法[4,10-11]、磁性材料法[12]、冷冻去脂法[13]、QuEChERS 法[14-16]等；底泥中主要有固相萃取法[17-18]、加速溶剂萃取法[19-20]、超声法[21]、凝胶渗透色谱法[22]、QuEChERS 法[14]等。与其他前处理方法相比，QuEChERS 法具有操作简便、检测成本低、环境友好、检测高效等优势，而且还可准确分离出残留的农药成分[23]。因此，本研究选取QuEChERS 方法作为样品前处理方法。水产品中农药残留的检测方法主要有气相色谱法[6]、气相色谱-质谱联用法[9-11]、液相色谱法[24]、液相色谱-质谱联用法[4,7]等。底泥中农药残留的检测方法主要有气相色谱法[19,21]、气相色谱-质谱联用法[18,20]、液相色谱-质谱联用法[14,17]等。但有关水产品和养殖环境介质 (底泥) 中农药残留的同时研究还不多见，现有的检测方法多存在检测目标物单一、种类少的缺点。鲫鱼是我国常见的淡水鱼类，富含蛋白质，可增强人体抵抗力。本研究在参考《水产养殖用药明白纸2022 年1、2 号》述及的农药种类的基础上，结合针对水产养殖户通常会使用的清塘农药的走访调研结果，以鲫鱼为研究对象，针对酰胺类、三嗪类、苯基吡唑类、有机氯和有机磷类等常见的清塘农药，在QuEChERS 样品前处理方法的基础上，通过优化提取和净化条件，建立了可同时检测鲫鱼及产地底泥中41 种清塘常用农药的GC-MS/MS 分析方法，并对方法的适用性进行了验证。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 7890B/7000D 气相色谱-串联质谱仪，配有EI 离子源 (美国Agilent 公司)；艾本德5804R冷冻高速离心机 (德国Eppendorf 公司)；KQ-500DE 数控超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司)；OA-SYS/N-EVAP-112 氮吹仪 (美国Organomation 公司)；MS7610-33 漩涡振荡器 (美国Thermo Fisher 公司)；Milli-Q Direct 8 超纯水仪(美国Millipore 公司)；AR1502CN 电子天平 (奥豪斯仪器有限公司)。

41 种农药标准品，均购自农业农村部环境保护科研监测所，质量浓度除特丁津、敌草净和西草净为1000 mg/L 外，其余均为100 mg/L (液态标准物质)。

十八烷基硅烷 (C18，40～63 μm)、乙二胺-N-丙基硅烷 (PSA，40～63 μm)、石墨化碳黑 (GCB，105～125 μm)、酸性氧化铝 (7G010005)、碱性氧化铝 (AG010005) 和硅藻土 (545) (德国CNW 公司)；弗罗里硅土 (150～250 μm) (美国WZ.der.Floridin 公司)；超纯硅胶 (60～200 μm) (加拿大SiliCycle 公司)；EMR 净化管 (5982～1010) (美国Agilent 公司)；二氧化锆 (B2006071) (上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；乙酸乙酯、环己烷 (色谱纯) (德国默克公司)；其余试剂为国产分析纯。0.22 μm滤膜、1 mL 注射器和2 mL 样品瓶 (上海安谱实验科技股份有限公司)；试验用水为Milli-Q Direct 8 超纯水仪制备的超纯水。

1.2 检测条件

色谱条件：HP-5MS 色谱柱 (30 m × 0.25 mm，0.25 μm，美国安捷伦科技有限公司)；碰撞气为氮气，流速为1.5 mL/min；载气为氦气，流速为2.25 mL/min；传输线温度280 ℃；进样口温度290 ℃；进样体积1.0 μL；不分流进样，不分流时间为1 min；柱升温程序：初始温度60 ℃保持1 min，以40 ℃/min 升至170 ℃，再以10 ℃/min升至310 ℃，保持3 min。

质谱条件：电子轰击离子源 (EI)；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；电离能70 eV；质谱接口温度280 ℃；动态多反应监测模式 (dMRM)；总运行20.75 min。41 种农药的保留时间及质谱参数 (按出峰顺序) 见表1，总离子流图见图1。

图1 乙酸乙酯中41 种农药的总离子流图(溶剂标，添加水平为0.1 mg/L)Fig.1 Total ion chromatogram (TIC) of 41 pesticides in ethyl acetate (solvent standard and spiked at 0.1 mg/L)

表1 41 种农药的保留时间及质谱分析参数Table 1 Retention time and mass spectrometric parameters for analysis of 41 pesticides

1.3 样品前处理方法

1.3.1 鲫鱼 准确称取5.00 g 均质样品于50 mL离心管中，加入5.00 mL 水 和10.00 mLV(乙腈) :V(乙酸乙酯) = 1 : 1 混合溶液，涡旋1 min 后超声20 min；加入2.0 g 氯化钠，涡旋1 min 后于6000 r/min、-4 ℃下冷冻离心5 min；取6 mL 上清液于15 mL 离心管中，加入900 mg 无水硫酸镁和600 mg 碱性氧化铝，涡旋30 s 后于10 000 r/min、-4 ℃下冷冻离心5 min；取4.00 mL 上清液于5 mL试管中，40 ℃水浴氮吹至近干，用2.00 mL 乙酸乙酯复溶，过0.22 μm 滤膜，待测。

1.3.2 底泥 准确称取5.00 g 经阴凉处自然风干后拣出杂质、过0.25 mm 筛后的底泥样品于50 mL离心管中，加入5.00 mL 水和10.00 mL 乙酸乙酯，涡旋1 min 后超声20 min；加入2.0 g 氯化钠，涡旋1 min 后于6000 r/min、-4 ℃下冷冻离心5 min；取6 mL 上清液于15 mL 离心管中，加入900 mg 无水硫酸镁和600 mg 弗罗里硅土、150 mg GCB，涡旋30 s 后于10 000 r/min、-4 ℃下冷冻离心5 min；取4.00 mL 上清液于5 mL 试管中，在40 ℃水浴中氮吹至近干，用2.00 mL 乙酸乙酯复溶，过0.22 μm 滤膜，待测。

1.4 标准溶液配制

标准品混合中间液1 (1.00 mg/L)：准确移取特丁津、敌草净和西草净标准品各0.010 mL，其余38 种农药标准品各0.10 mL 于10 mL 容量瓶中，用乙酸乙酯定容，配制成质量浓度为1.00 mg/L 的标准品混合中间液1，于4 ℃密闭保存于聚丙烯容器瓶中，备用。

标准品混合中间液2 (0.10 mg/L，以α-六六六计)：按鲫鱼中41 种农药标准品的定量限比例，分别移取一定体积的农药标准品溶液于10 mL 容量瓶中，用乙酸乙酯定容，配制成质量浓度为0.10 mg/L 的标准品混合中间液2，于4 ℃密闭保存于聚丙烯容器瓶中，备用。

标准品混合中间液3 (0.10 mg/L，以α-六六六计)：按底泥中41 种农药标准品的定量限比例进行配制，方法同上，于4 ℃密闭保存于聚丙烯容器瓶中，备用。

1.5 检出限及定量限和线性范围

1.5.1 检出限 (LOD) 及定量限 (LOQ) 分别以阴性鲫鱼和底泥样品为基质，采用空白基质添加标准品 (标准品混合中间液1) 的方法配制基质匹配标准混合工作溶液，分别得到0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1、2 和5 μg/L 系列质量浓度的基质匹配标准混合工作溶液1 (鲫鱼样品) 和2 (底泥样品)，按1.2 节的条件测定，以质量浓度为横坐标，质谱定量离子的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。参考GB/T 33260.2—2018 计算目标物的仪器LOD[25]。方法LOQ 以最小添加浓度且可准确定量的水平予以评价。

1.5.2 线性范围 确定了方法LOQ 后，同样采用空白基质添加标准品 (分别为标准品混合中间液2 和3) 的方法，分别得到0.10、0.20、0.50、1、2 和5 μg/L (以α-六六六计) 系列质量浓度的基质匹配标准混合工作溶液3 (鲫鱼样品) 和4 (底泥样品)，按1.2 节的条件测定，计算线性范围，绘制标准曲线。

2 结果与分析

2.1 样品前处理方法的优化

2.1.1 鲫鱼和底泥中提取溶剂的选择 分别考察了以乙腈、甲醇、正己烷、乙酸乙酯、环己烷和V(乙腈) :V(乙酸乙酯) = 1 : 1 混合溶剂作为提取溶剂时，鲫鱼肉中41 种目标物的提取效果；以及以乙腈、乙酸乙酯、正己烷和石油醚作为提取剂时，底泥中目标物的提取效果。结果 (表2) 表明：1) 鲫鱼肉中，甲醇的提取效率低；虽然乙酸乙酯、环己烷和正己烷的提取效果较好，但同时有大量色素等杂质被提取，不利于后续净化；乙腈的提取效果也很好，但价格、毒性均比乙酸乙酯高；V(乙腈) :V(乙酸乙酯) = 1 : 1 混合溶剂提取效果好，且提取液颜色浅，故鲫鱼样品最终选择V(乙腈) :V(乙酸乙酯) = 1 : 1 混合溶剂为提取溶剂。2) 底泥样品中，乙腈和乙酸乙酯的提取效率均较好，考虑到价格、毒性等因素，最终选择以乙酸乙酯为提取溶剂。

表2 不同提取溶剂对41 种农药提取效果的影响(n = 3)Table 2 Extraction effect of the 41 pesticides using different extraction solvents (n = 3)

2.1.2 鲫鱼和底泥中净化条件优化

2.1.2.1 净化剂的选择 鲫鱼和养殖底泥样品基质成分比较复杂，鲫鱼中含有脂肪和蛋白质等干扰成分，底泥中含有腐殖质和色素等杂质，可能对色谱分离效果及仪器灵敏度等造成一定程度的影响，从而影响定性和定量分析结果，故需对样品进行净化。本文分别选择C18、PSA、GCB、超纯硅胶、弗罗里硅土、硅藻土、酸性氧化铝、碱性氧化铝、EMR 和二氧化锆等常见的10 种固相萃取柱填料作为备选净化材料，首先对比研究了其对目标物的吸附情况。结果显示，鲫鱼肉中10 种净化剂 (图2) 和底泥样品中8 种净化剂 (图3) 对目标物的吸附性均不强，目标物的回收率均在70%～120%之间，可达到要求。

图2 不同净化剂组合对鲫鱼中41 种农药回收率的影响Fig.2 Effect on the recoveries of 41 pesticides in crucian carp using different cleaned-up sorbents

图3 不同净化剂组合对底泥中41 种农药回收率的影响Fig.3 Effect on the recoveries of 41 pesticides in bottom sediment using different cleaned-up sorbents

2.1.2.2 基质效应 采用GC-MS/MS 仪进行残留测定时应尽量避免基质效应 (ME)[26-27]，同时ME也可反映净化效果。本文采用相对响应值法对ME 进行评价 (ME = 空白基质标准响应值/纯溶剂标准响应值)，当0.8 ≤ ME ≤ 1.2 时基质效应不明显，当ME ＞ 1.2 时为基质增强效应，当ME ＜0.8 时为基质抑制效应[28]。结果 (图4、5 和表3)显示：碱性氧化铝 (净化剂组合V) 对鲫鱼肉样品提取液的净化效果最优；GCB (净化剂组合VIII)对底泥样品提取液的净化效果最优，其次是弗罗里硅土。

图4 不同净化剂组合对鲫鱼中41 种农药的基质效应评价Fig.4 The matrix effects of 41 pesticides in crucian carp using different cleaned-up sorbents

图5 不同净化剂组合对底泥中41 种农药的基质效应评价Fig.5 The matrix effect of 41 pesticides in bottom sediment using different cleaned-up sorbents

表3 不同净化剂组合对鲫鱼和底泥样品中41 种农药的基质效应评价Table 3 The matrix effects of 41 pesticides in crucian carp and bottom sediment using different cleaned-up sorbents

2.1.2.3 净化剂用量的优化 为了提高净化效果，降低ME，进一步对比了不同用量碱性氧化铝(300、450、600、750、900 mg) 对鲫鱼肉样品提取液的净化效果和不同用量GCB、弗罗里硅土组合 (150 mg 弗罗里硅土 + 150 mg GCB、150 mg 弗罗里硅土 + 300 mg GCB、300 mg 弗罗里硅土 +150 mg GCB、300 mg 弗罗里硅土 + 300 mg GCB、450 mg 弗罗里硅土 + 150 mg GCB、450 mg 弗罗里硅土 + 300 mg GCB、600 mg 弗罗里硅土 + 150 mg GCB、600 mg 弗罗里硅土 + 300 mg GCB) 对底泥样品提取液的净化效果。结果 (图2、3、4、5 和表3) 表明，鲫鱼肉样品中600 mg 碱性氧化铝 (净化剂组合XIV)、底泥样品中600 mg 弗罗里硅土 +150 mg GCB (净化剂组合XVI) 的净化效果最优，且回收率均可达到要求。为提高灵敏度，本文对样品进行了浓缩，结果显示目标物的回收率亦均可达到要求。

综上，鲫鱼中净化剂最终选择600 mg 碱性氧化铝 (净化剂组合XVII)、底泥中选择600 mg 弗罗里硅土 + 150 mg GCB (净化剂组合XVIII)，并选用空白基质匹配标准溶液外标法，绘制标准曲线进行定量的方式来减弱基质效应的影响。

2.2 方法评价

2.2.1 线性范围、检出限 (LOD) 及定量限 (LOQ)

采用1.5.1 节的方法，对LOD 和LOQ 进行评价。结果 (表4) 表明，鲫鱼肉和底泥样品中仪器LOD 均在0.05～2.5 μg/L 之间，方法LOQ 均在0.1～5.0 μg/kg 之间。

表4 41 种农药在鲫鱼及底泥中的线性回归方程、相关系数、检出限和定量限Table 4 Linear regression equation, correlation coefficient (r), LOD and LOQ of 41 pesticides in crucian carp and bottom sediment

采用1.5.2 节的方法，对方法线性范围进行评价。结果 (表4) 表明，鲫鱼样品中目标物的线性相关系数 (r) 在0.9960～0.9999 之间，底泥样品中目标物的r在0.9964～1.000 之间，均能够满足定量分析的基本要求[29]。

2.2.2 方法的正确度和精密度 分别向鲫鱼肉和底泥样品中添加LOQ、2LOQ 和10LOQ3 个水平的标准品混合中间液2 和3，每个水平重复6 次。由表5 可知，41 种农药在鲫鱼样品中的平均回收率在73%～116%之间，RSD 在0.65%～13%之间(n= 6)；在底泥样品中的平均回收率在73%～104%之间，RSD 在0.051%～10%之间 (n= 6)。表明方法具有较好的正确度和精密度[29]。

2.3 方法应用

为了进一步验证方法的可行性，运用建立的方法对从市场购买的青鱼、草鱼、鲢鱼、鳙鱼、鲤鱼、青虾、小龙虾等共16 个养殖类水产品和清塘一段时间后采集的14 个底泥样品进行分析。结果发现 (表6)：16 个水产品样品中检出8 种农药，检出率在6%～56%之间；14 个底泥样品中检出5 种农药，检出率在7%～93%之间。参考《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》[30]，所有检出农药残留均未超标。

表6 实际市场抽检样品中41 种农药残留检测结果Table 6 Detection results of 41 pesticides in market samples

本研究中，水产品和底泥中持久性有机污染物滴滴涕系列的检出率较高，这可能是因为有机氯农药虽然目前早已不再使用，但由于其化学结构稳定且当年的大量使用，自然条件下不易被降解，至今在地表土壤和农产品中的残留量仍然很高[31]。

3 结论

本研究建立了鲫鱼和底泥中41 种常用清塘农药的GC-MS/MS 快速检测方法。使用改良的QuEChERS 前处理方法，基质匹配外标法标准曲线定量。对测定方法进行方法学验证，结果表明：1) 鲫鱼中41 种农药的方法LOQ 在0.1～5.0 μg/kg之间，r在0.9960～0.9999 之间；在LOQ、2 LOQ和10 LOQ 3 个添加水平下的平均回收率在73%～116% 之间，RSD 在0.65%～13% 之间 (n= 6)。2) 底泥中41 种农药的方法LOQ 在0.1～5.0 μg/kg之间，r在0.9964～1.000 之间；在LOQ、2 LOQ和10 LOQ 3 个添加水平下的平均回收率在73%～104%之间，RSD 在0.051%～10%之间 (n= 6)。该方法准确、快捷、灵敏，为我国水产品中农药残留的高通量快速检测以及食品安全提供了科学支持和技术保障，对于推进政府监管部门执法、提高检测效率、降低检测成本等均具有一定的实际意义和社会效益，可应用于水产品食品安全日常监测。