罗 飞, 穆 青, 余知和, 孙美丽, 郭 涛,李文红, 汪汉成, 蔡刘体

(1.长江大学 生命科学学院，湖北 荆州 434025；2.贵州省烟草科学研究院，贵阳 550081；3.贵州省烟草公司 黔西南州公司，贵州 兴义 562400；4.贵州省农业科学院 植物保护研究所，贵阳 550006；5.长江大学 农学院，湖北 荆州 434025)

茄科劳尔氏菌Ralstonia solanacearum是一种土壤习居细菌[1]，其遗传变异性高、环境适应能力强、寄主范围广，是制约全球农业生产的重要植物病原之一[2-3]。烟草是我国重要经济作物，由于连作、气候变化、防治药剂单一等因素，导致由茄科劳尔氏菌引发的烟草青枯病的发病频率和范围均呈不同程度增加。烟草青枯病通常会导致烟叶品质和产量下降，在发病严重地块甚至造成绝收[4]。目前，生产上对烟草青枯病的防治措施主要集中在培育抗病烟草品种[5]、筛选适宜的生防菌[6]和使用化学药剂[7]等方面。然而，不同的防控措施均存在一定的局限性。化学防控因见效快、成本低等特点而成为烟草青枯病的主要防控手段，但可有效防控烟草青枯病的药剂仍十分有限。因此，亟待筛选能高效防治烟草青枯病的新药剂。

碳源是影响植物病原菌生存和致病性的重要营养物质[8]。有研究表明，Biolog OmniLog 系统中可使用包括Biolog GEN Ⅲ 在内的多种微平板检测微生物对碳源代谢、pH 耐受性、盐耐受性和还原力等多种生理特征[9-11]。Wang 等[12-13]利用Biolog FF 微平板研究表明，在药剂胁迫下，灰葡萄孢Botrytis cinerea减少了产孢所需碳源的种类，而九州镰刀菌Fusarium kyushuense降低了对糖酵解和三羧酸循环中多种碳源的代谢。Chojniak 等[14]利用Biolog ECO 和PM 微平板分别对沙雷氏菌Serratia marcescens的生理特征和耐药性进行研究，发现沙雷氏菌可利用D-甘氨酸、L-天冬酰胺和L-丝氨酸在内的31 种碳源，且对氟啶酸、亚碲酸钾、巴龙霉素、新生霉素和萘啶酸敏感，对洁霉素、红霉素和奇霉素等43 种药剂则均具有耐药性。了解不同药剂胁迫下茄科劳尔氏菌的碳源代谢特征，对准确挖掘可高效防治烟草青枯病的化学药剂，以及深入探究药剂对茄科劳尔氏菌的毒理作用机制尤为重要[15]。为此，本研究分别通过平板菌落计数法和Biolog GEN Ⅲ 微平板法，测定了中生菌素等5 种药剂对茄科劳尔氏菌的抑制活性，以及菌株在药剂胁迫压力下的碳代谢特征，旨在为筛选高效防治烟草青枯病的药剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

菌株：茄科劳尔氏菌R.solanacearumRS-1 菌株由贵州省烟草科学研究院微生物实验室保存，在营养琼脂 (NA) 培养基上活化后用于后续试验。

药剂：20%中生菌素 (zhongshengmycin) 以及92%氯溴异氰尿酸 (chlorobromoisocyanuric acid)和95%噻霉酮 (benziothiazolinone) 原药，由南京农业大学植物保护学院杀菌剂实验室提供；98%春雷霉素 (kasugamycin) 购自源叶生物科技有限公司；930 U/mg 土霉素 (oxytetracycline) 购自索莱宝生物科技有限公司。先将上述药剂配制成质量浓度为1.0 × 104mg/L 的母液，其中，春雷霉素、中生菌素、土霉素和氯溴异氰尿酸用无菌水溶解配制，噻霉酮用丙酮溶解配制。母液经0.2 μm 的微孔滤膜 (#FJ0612 Pall Corporation) 过滤除菌后，置于4 ℃避光条件下存放，备用。

营养琼脂 (NA) 培养基：牛肉浸膏3 g，氯化钠5 g，蛋白胨10 g，琼脂15 g，水1 L，用于菌株活化培养及抑菌活性测定；CPG 培养基：酪蛋白水解物1 g，蛋白胨10 g，蔗糖5 g，水1 L，用于茄科劳尔氏菌菌液培养。

Biolog GEN III 微平板 (货号：#1030)、IF-A(#72401) 接种液、Biolog OmniLog 系统 (#91372)和 8 通道电动移液器 (#3501A)，购自美国 Biolog公司。

1.2 药剂对茄科劳尔氏菌的抑制活性测定

采用平板菌落计数法[16]测定5 种供试药剂对茄科劳尔氏菌的抑制活性。根据预试验结果，分别配制含不同药剂梯度浓度的NA 平板。其中，中生菌素、土霉素和噻霉酮：0、0.0625、0.125、0.25、0.50、1 和2 mg/L；春雷霉素：0、0.625、1.25、2.50、5、10 和20 mg/L；氯溴异氰尿酸：0、25、50、100、200、400 和800 mg/L；以不添加药剂的NA 平板为空白对照。

挑取NA 平板上预培养的单菌落接种于CPG培养基中，于28 ℃、180 r/min、黑暗条件下培养12 h。移取50 μL 稀释后的菌悬液 (106cfu/mL) 涂布于各含药NA 平板上，28 ℃黑暗培养48 h，统计每个平板的菌落数量。根据菌落数量平均值，按式 (1)计算不同药剂的抑制率 (I)。每浓度3 次重复。

其中，NC为对照组菌落数量；NT为处理组菌落数量。

1.3 药剂胁迫下茄科劳尔氏菌的代谢测定

采用IF-A 接种液配制浊度为90%～98% TU 的茄科劳尔氏菌菌悬液[14]。根据平板计数结果，将各药剂分别加入菌悬液中，配制药剂质量终浓度分别为：中生菌素0、1.5、6 mg/L，土霉素0、1、8 mg/L，春雷霉素0、15、30 mg/L，噻霉酮0、2、8 mg/L，氯溴异氰尿酸0、274、5738 mg/L，并设不含药剂的空白对照组 (CK)。采用多孔道移液器将含各浓度药剂的菌悬液分别加至不同GENⅢ 微平板中，每孔100 μL，置于Biolog OmniLog表型芯片系统内，28 ℃孵育4 d，通过读取颜色值的变化，检测茄科劳尔氏菌对71 种碳源的代谢情况以及对不同pH 值和包括不同浓度NaCl 在内的 23 种化学物质的敏感性差异。

1.4 数据统计与分析

利用Excel 软件 (V2021) 求得毒力回归方程、相关系数 (r)、各药剂对茄科劳尔氏菌的半数抑制效应浓度 (EC50) 和90%抑制效应浓度 (EC90)；使用Heml (V1.0.3.3) 绘制茄科劳尔氏菌的代谢丰度热图。

2 结果与分析

2.1 供试 5 种药剂对茄科劳尔氏菌的抑制活性

各药剂不同浓度处理下，茄科劳尔氏菌菌落生长情况如图1 所示。低浓度下，茄科劳尔氏菌在含药平板上的生长状况与空白对照组无显著性差异；随着药剂质量浓度升高，菌落大小和数量均受到不同程度的抑制。5 种杀菌剂对茄科劳尔氏菌生长的抑制效果由强到弱依次为中生菌素 ＞ 土霉素 ＞ 噻霉酮 ＞ 春雷霉素 ＞ 氯溴异氰尿酸，对应的EC50值分别为0.24、0.74、2.84、7.95 和273.99 mg/L (表1)。依据本试验结果，初步可认为中生菌素对茄科劳尔氏菌的抑制作用较强，春雷霉素、土霉素和噻霉酮的抑制作用较弱，而氯溴异氰尿酸的抑制效果最差。

表1 供试5 种药剂对茄科劳尔氏菌的抑制活性Table 1 Inhibitory activity of five chemicals against R.solanacearum

图1 不同浓度药剂处理下茄科劳尔氏菌的菌落生长情况Fig.1 Growth of Ralstonia solanacearum under the treatments of five chemicals

2.2 5 种药剂胁迫下茄科劳尔氏菌的代谢能力分析

药剂对病原菌的抑制活性越强，病原菌对GEN Ⅲ 微平板中碳源的代谢程度就越弱。在不同浓度5 种药剂胁迫下，茄科劳尔氏菌对GEN Ⅲ微平板中71 种碳源的代谢情况如图2 所示。结果表明：无药剂胁迫时，71 种碳源均能被茄科劳尔氏菌代谢，其中能被高效代谢的有糊精、α-D-葡萄糖和α-酮-戊二酸等47 种碳源。在不同浓度中生菌素 (1.5、6 mg/L)、土霉素 (1、8 mg/L)、噻霉酮 (2、8 mg/L)、氯溴异氰尿酸 (274、5734 mg/L)和春雷霉素 (15 mg/L) 胁迫下，与空白对照组相比，茄科劳尔氏菌对71 种碳源的代谢程度均受到不同程度抑制，其中氨基酸、己糖酸和羧酸、酯和脂肪酸类碳水化合物受到的抑制作用最显著。

图2 供试5 种药剂胁迫下茄科劳尔氏菌代谢功能聚类热图Fig.2 Cluster heat map of carbon metabolic function of R.solanacearum under pressure of five agents

5 种药剂不同浓度之间对茄科劳尔氏菌碳源代谢的影响存在显著差异。在低质量浓度 (1.5 mg/L中生菌素、1 mg/L 土霉素、2 mg/L 噻霉酮、15 mg/L春雷霉素和274 mg/L 氯溴异氰尿酸) 药剂胁迫下，茄科劳尔氏菌能高效代谢的碳源种类分别为3、0、1、7 和1 种，代谢程度较低的碳源种类分别为68、71、70、64 和70 种；随着药剂质量浓度升高，在6 mg/L 中生菌素、8 mg/L 土霉素、8 mg/L噻霉酮、30 mg/L 春雷霉素和5738 mg/L 氯溴异氰尿酸胁迫下，能高效代谢的碳源种类分别为0、0、1、4 和2 种，代谢程度较低的碳源种类分别为71、71、70、67 和69 种；表明随药剂质量浓度增加，茄科劳尔氏菌对GEN Ⅲ 微平板中碳源的代谢能力整体呈降低趋势。

同一药剂不同浓度之间对茄科劳尔氏菌碳源代谢的影响也存在差异。随着中生菌素、土霉素、噻霉酮、春雷霉素和氯溴异氰尿酸质量浓度增加，相较于低质量浓度下，在6 mg/L 中生菌素、8 mg/L 土霉素、8 mg/L 噻霉酮、30 mg/L 春雷霉素和5738 mg/L 氯溴异氰尿酸胁迫下，5 种药剂对65、18、71、60 和7 种碳源的代谢程度分别降低，同时对6、53、0、10 和60 种碳源的代谢程度分别增强。所有处理中，茄科劳尔氏菌对D-丝氨酸和α-酮-丁酸的代谢程度均较低，推测茄科劳尔氏菌对D-丝氨酸和α-酮-丁酸的利用能力较弱。此外值得注意的是，在不同浓度的春雷霉素、噻霉酮、土霉素胁迫下，茄科劳尔氏菌对D-果糖-6-磷酸的代谢程度均高于对D-葡糖-6-磷酸，而在氯溴异氰尿酸胁迫下却刚好相反。

2.3 5 种药剂胁迫下茄科劳尔氏菌对化学物质的敏感性

在不同浓度的5 种药剂胁迫下，茄科劳尔氏菌对GEN Ⅲ 微平板中23 种化学物质的敏感性表现不同 (图2)。其中，茄科劳尔氏菌对低pH 值(5) 的敏感性均高于高pH 值 (6)；而对不同浓度NaCl (1%、4%、8%，质量分数) 的敏感性则随NaCl 浓度升高而升高。在无药剂胁迫时，茄科劳尔氏菌对GEN Ⅲ 微平板中的醋竹桃霉素、盐酸胍、二甲胺四环素、D-丝氨酸、硫酸四癸钠、丁酸钠、溴酸钠和氯化锂8 种化学物质敏感性较高，而对乳酸钠、梭链孢酸、利福霉素SV、氨曲南、亚碲酸钾、萘啶酮酸、四唑蓝、四唑紫、万古霉素及林肯霉素10 种化学物质的敏感性较低。在低质量浓度药剂 (15 mg/L 春雷霉素、2 mg/L 噻霉酮、1 mg/L 土霉素、1.5 mg/L 中生菌素和274 mg/L 氯溴异氰尿酸) 胁迫下，茄科劳尔氏菌对乳酸钠、万古霉素和盐酸胍等18 种化学物质的敏感性相较于空白对照均不同程度升高；随着药剂质量浓度升高，与空白对照相比，茄科劳尔氏菌对GEN Ⅲ 微平板中23 种化学物质的敏感性则分别呈升高或降低趋势。

3 结论与讨论

由茄科劳尔氏菌引起的烟草青枯病是烟叶生产上的主要病害，常给烟农造成严重经济损失[5,17-18]，化学防治是其最为经济有效的防控手段之一。本研究发现，春雷霉素、土霉素、噻霉酮、中生菌素和氯溴异氰尿酸5 种药剂对茄科劳尔氏菌的生长均表现出不同程度的抑制作用，抑菌活性由强到弱依次为中生菌素(EC50= 0.24 mg/L) ＞ 土霉素(EC50= 0.74 mg/L) ＞ 噻霉酮(EC50= 2.84 mg/L) ＞春雷霉素(EC50= 7.95 mg/L) ＞ 氯溴异氰尿酸(EC50=273.99 mg/L)，所得结果与前人对番茄青枯菌及生姜青枯菌的测定结果类似[19-22]。

药剂作用方式不同可能会导致其对病原菌毒力效应的不同。本研究所选5 种药剂均是直接作用于病原菌，其中中生菌素、土霉素和春雷霉素主要通过抑制菌体蛋白质合成[23-25]，噻霉酮通过破坏病原菌细胞核结构和干扰细胞的新陈代谢，使其生理紊乱[26]，氯溴异氰尿酸则是通过释放的Cl-和Br-形成次氯酸和次溴酸分子而发挥抑菌作用，但次氯酸和次溴酸极不稳定[27]，因而可能影响氯溴异氰尿酸的抑菌活性。同样，环境pH 值也可能会影响药剂对病原菌的抑制活性。本研究中，茄科劳尔氏菌在无药剂处理和不同浓度的5 种药剂胁迫下，在pH 值为6 时对GEN Ⅲ 微平板中碳源的代谢程度均高于pH 值为5 时。pH 值具体如何影响药剂对茄科劳尔氏菌的抑制活性值得进一步深入研究。何宗桃[26]报道，春雷霉素在弱酸环境下活性更高，本研究结果与之相比结果相反。本研究仅测定了pH 为5 和6 两种环境条件下药剂的抑制活性，后续还有待测定更宽pH 范围下药剂对茄科劳尔氏菌的抑制活性，以便明确供试5 种药剂的施用最适pH 值。研究表明，中生菌素、土霉素和噻霉酮是对茄科劳尔氏菌防控效果较为理想的药剂，春雷霉素次之，氯溴异氰尿酸较差。

根据不同微生物在利用GEN Ⅲ 微平板中不同碳源时表现出不同代谢指纹图谱的特性，可将病原菌鉴定到种水平，同样，同一微生物在不同环境下对同一碳源的利用情况也会有所不同[28-30]。本研究采用Biolog GEN Ⅲ 微平板，分析了茄科劳尔氏菌对碳源的利用情况，发现在5 种药剂胁迫下，α-酮-戊二酸、柠檬酸、L-苹果酸、D-葡糖-6-磷酸和D-果糖-6-磷酸等多种碳源的代谢均受到高水平抑制。其中D-半乳糖醛酸和葡萄糖醛酰胺(己糖酸类碳水化合物) 参与2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸(KDPG)和糖醛酸等多种生化途径；而α-酮-戊二酸、柠檬酸、L-苹果酸是三羧酸(TCA)循环中的重要物质；D-葡糖-6-磷酸和D-果糖-6-磷酸(磷酸己糖)是微生物进行糖代谢的一类重要碳水化合物，但D-葡糖-6-磷酸和D-果糖-6-磷酸所参与的代谢途径不同[31]。茄科劳尔氏菌在不同浓度5 种药剂胁迫下对D-葡糖-6-磷酸和D-果糖-6-磷酸的利用程度存在差异，推测茄科劳尔氏菌在5 种药剂胁迫下进行糖代谢的途径不同。上述结果表明，中生菌素、土霉素、噻霉酮、春雷霉素和氯溴异氰尿酸5 种药剂均可抑制茄科劳尔氏菌对多种碳源的生化代谢途径，其中，中生菌素、噻霉酮、土霉素和春雷霉素对茄科劳尔氏菌的抑制活性测定结果与Biolog 碳源代谢结果相符，抑制活性和碳源代谢强度均与药剂质量浓度成正比效应。

目前，由于单一药剂的长期、多频次不合理使用易造成病原菌的抗药性问题[4]，因此将多种不同类型药剂进行复配后防治病害在实际生产中已被广泛应用[22,32-34]。本研究中关于茄科劳尔氏菌对化学物质敏感性测定部分所涉及的梭链孢酸、NaCl、醋竹桃霉素、利福霉素SV、林肯霉素和万古霉素等多种化学物质已被广泛应用于医学领域，这些化学物质与本研究测定的5 种药剂所形成的复配剂在Biolog 系统中均能显著降低茄科劳尔氏菌的代谢程度，但能否将其应用于烟草青枯病的防治还有待进一步研究。此外，本研究利用Biolog GEN III 系统，测定了在5 种药剂胁迫下茄科劳尔氏菌对71 种碳源的代谢情况和对23 种化学物质的敏感性差异，初步反映了药剂对病原菌代谢途径的影响，但具体还需通过Biolog phenotypic microarrays (PM)技术进一步深入探讨。