潘 峰，唐晓敏，潘利明，杨 全，张春荣

（广东药科大学中药学院/国家中医药管理局岭南药材生产与开发重点研究室/国家中药材产业技术体系广州综合试验站/广东省南药规范化种植与综合开发工程技术研究中心，广东广州 510006）

高良姜（Alpinia officinarumHance）为姜科山姜属多年生草本植物，其根状茎是亚欧国家常用的药材和香辛料，具有温胃止呕、散寒止痛的功效，常用于治疗脘腹冷痛、胃寒呕吐、嗳气吞酸等症[1]。高良姜药材及其所含的挥发油、黄酮类、二芳基庚烷类等化学成分具有镇痛止呕、抗炎、抗溃疡、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗癌、抗消化道出血、抗骨质疏松和降脂等药理活性[2-3]。除了药用，高良姜也可用于保健食品、香料、果蔬肉类防腐剂、粮面驱虫剂、日用化学品添加剂等，极具开发价值。

高良姜分布于我国广东雷州半岛、海南和广西南部等热带地区。进入21世纪以来，高良姜野生资源已濒临灭绝，市售商品均来自栽培资源[4,5]。高良姜种植采用根状茎营养繁殖，种源混杂，如无新品种选育推广，容易出现种源退化、药材质量降低等问题。分子生药学是在分子水平上研究生药的分类与鉴定、栽培与保护及有效成分生产的科学，由中国中医科学院黄璐琦院士于1995 年提出[6]。当前，分子生药学研究进入了快速发展期，在中药理论创新、质量控制、新品种选育等领域取得了很大进展[7]。分子生药学是解决高良姜资源鉴定、品种选育、栽培管理、药效成分生产的关键钥匙。因此，亟需应用高良姜系统进化、遗传多样性、分子鉴定和功能基因组学等研究成果，采用生物技术育种、分子标记辅助育种等途径培育高产优质的高良姜新品种，利用微生物发酵生产高良姜有效成分，促进高良姜资源研究与开发。

1 高良姜的系统进化与遗传多样性

1.1 系统进化

高良姜为姜科姜族山姜属良姜亚属植物。袁琳等应用相关序列扩增多态性（sequence-related amplified polymorphism,SRAP）分子标记技术对采自海南的11种姜科植物进行遗传关系分析，发现高良姜与同属的红豆蔻（Alpinia galanga）和光叶山姜（Alpinia intermedia）的遗传关系较近，但与益智（Alpinia oxyphylla）、草豆蔻（Alpinia katsumadai）、海南山姜（Alpinia hainanensis）位于不同的分支上[8]。黄琼林研究基于叶绿体基因组序列的高良姜与17 种单子叶植物系统发育关系，发现高良姜首先与艳山姜（Alpinia zerumbet）聚集，再与益智聚集，然后与姜科其他属的植物聚集成姜科分支[9]。Yang 等分析基于19 种姜科植物共有77个叶绿体基因序列的系统发育，结果表明山姜属的物种分布在两个主要分支中：红豆蔻和黑果山姜（Alpinia nigra）组成第一个分支，高良姜与其他山姜属植物组成第二个分支，其中高良姜与益智构成姊妹种[10]。Yang 等构建基于高良姜、红豆蔻、黑果山姜、益智4 种山姜属植物在被子植物mega 353 基因库中组装的4 个共有基因（AT4G04780、AT3G53760、AT5G53800、AT1G06240）系统发育树，结果表明红豆蔻是黑果山姜姊妹种，高良姜是益智姊妹种，与基于叶绿体基因标记推断的系统发育结果一致[10]。

按照传统形态学分类观点，上述山姜属植物中，高良姜和益智均为良姜亚属植物，而艳山姜、海南山姜为艳山姜亚属植物，红豆蔻与光叶山姜、花叶山姜为山姜亚属植物，黑果山姜为黑果山姜亚属植物。袁琳等研究结果中高良姜与同为良姜亚属的益智遗传关系较远，而与山姜亚属的红豆蔻、光叶山姜遗传关系较近，表明依靠单一引物对的SRAP 分子标记进行种间遗传多样性分析的结果与传统分类观点存在差异[8]。黄琼林研究结果中高良姜先与艳山姜聚集，再与益智聚集[9]。Yang 等研究结果中高良姜的系统发育关系与传统分类观点一致，但红豆蔻与黑果山姜聚集，而未与华山姜、花叶山姜聚集[10]。由此可见，基于叶绿体基因组全长序列或特定序列进行系统分类在科、属等级上与传统的分类观点通常一致，但在亚属等级上还需要结合其他基因序列和分类学依据。

1.2 遗传多样性

遗传多样性是同一群体中不同个体或同一物种内不同群体遗传变异的总和，物种遗传多样性越高，对环境变化适应能力就越强。DNA 分子标记是揭示物种遗传多样性的主要方法之一，许多学者应用扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)、简单重复序列(simple sequence repeat，SSR)、简单重复序列区间标记(inter-simple sequence repeat，ISSR)等分子标记技术研究了高良姜的遗传多样性。

1.2.1 AFLP分子标记

庞启华等对13 个高良姜居群进行AFLP 分子标记研究，发现产自徐闻县的高良姜居群内的DNA 多态性比其他地方的低，可能与徐闻县悠久的高良姜无性繁殖种植历史有关[11]。杨全等对8 个种源地的高良姜资源进行AFLP 分子标记，得到了1044 个多态性位点，占比达92.57%，揭示了高良姜种质间存在较高多态性，遗传多样性丰富[12]。

1.2.2 SSR分子标记

黄琼林从基于二代测序的高良姜转录组序列中鉴定到13346 个SSR 位点，随机挑选10 对SSR 引物对高良姜基因组DNA 进行PCR 扩增，有8 对引物可扩增出与预期相符的产物，有1 对引物的扩增产物在不同居群高良姜样品中呈现多态性[13]。赵全杰等基于三代测序的高良姜全长转录组序列设计了100 对SSR 引物，对7 种高良姜栽培类型进行EST-SSR 分析，有21 对引物的扩增条带清晰且稳定，由此构建了高良姜栽培类型的EST-SSR数字指纹图谱及鉴别方法[14]。

1.2.3 ISSR分子标记

潘坤等采用ISSR 分子标记技术对来自海南8 个居群的96份高良姜样品进行遗传多样性分析，发现海口的2 个居群聚为一类，琼山、澄迈、兴隆、儋州、临高等6 个居群聚为第二类，说明这些产地的高良姜种源较一致，存在引种迁移和混合栽培现象[15]。由于种源单一且长期依靠无性繁殖造成海南高良姜在居群水平和物种水平的遗传多样性均不丰富。

2 高良姜的分子鉴别与功能基因组学

2.1 分子鉴别

许多姜科植物的器官形态相似，药材性状相近，混淆品较为常见。基于DNA 序列的分子鉴定技术是鉴别性状相似药材的常用方法。许多学者对高良姜及其混淆品的核基因组中的核糖体DNA 内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）和叶绿体基因组中的成熟酶基因（maturase，matK）、1,5-二磷酸核酮糖羧化酶大亚基编码基因（ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/ oxygenase large subunit，rbcL）、细胞色素b6-f 复合体亚单位VIII-光系统II 蛋白M 基因间隔区（cytochrome b6-f complex subunit VIII-photosystem II protein M intergenic spacer，petN-psbM）、psaJ 和核糖体蛋白L33 基因（ribosomal protein L33）间隔区（psaJ-rpl33）序列差异进行了分析，寻找鉴别高良姜及其混淆品的DNA条形码标记。

2.1.1 ITS序列

庞启华等对高良姜、华山姜、山姜（Alpinia japonica）和大高良姜（红豆蔻）的ITS 序列进行比较，发现不同产地野生和栽培高良姜的ITS 序列高度一致，同源性极高，不能用于鉴别高良姜的产地和品种，但高良姜与三种混淆品的ITS 序列有11 个位点存在明显差异，可作为鉴别高良姜真伪的分子标记[16]。牛宪立也比较了不同来源的高良姜与大高良姜的ITS序列，二者存在32个变异位点，可作为鉴别高良姜和大高良姜的分子标记[17]。罗焜等比较了高良姜等16种山姜属植物的37 个样本的ITS2 序列，发现ITS2 不能用来鉴别高良姜种内差异，但可用于鉴别高良姜和其他山姜属植物[18]，与庞启华等[16]的结论一致。

2.1.2matK基因

黄琼林等比较了高良姜等11 种山姜属植物的24条matK 基因序列，发现了41 处变异位点，其中，85 bp 处的A-G 变异位点可以鉴别高良姜与除水山姜(Alpinia aquatica)外的其他物种，336 bp处的G-A 变异位点可以区别高良姜与除红豆蔻外的其他物种；基于matK序列进行聚类分析可将高良姜与其他山姜属植物明显区分开来[19]。庞启华等发现高良姜matK序列的种内变异很小，不能用来鉴别高良姜产地，但有18 个matK差异位点可以区别高良姜与大高良姜[20]。

2.1.3rbcL基因

黄琼林等比较了高良姜与其伪品大高良姜的rbcL基因序列，发现了3 处碱基差异，基于rbcL 基因的聚类树能较好地区分高良姜和大高良姜[21]。

2.1.4petN-psbM和psaJ-rpl33序列

Yang 等利用叶绿体基因组的2 个高变基因间隔区petN-psbM 和psaJ-rpl33 分别开发了2 个DNA 标记Alpp和Alpr，用于鉴别高良姜、红豆蔻、黑果山姜、益智、海南山姜5 种山姜属植物。Alpp 标记不能将高良姜和益智区分开来，但可将高良姜与其他山姜属植物区分出来，而Alpr 标记可将高良姜与其他4 种山姜属植物区分开来[10]。

2.2 功能基因组学

基因组学包括以全基因组测序为目标的结构基因组学和以基因功能鉴定为目标的结构基因组学，是解析药用动植物分子鉴定和系统发育、次级代谢途径、生长发育调控机制、药材道地性机制等关键科学问题的主要方法。

2.2.1 功能基因表达模式

挥发油成分是高良姜作为香辛料的重要质量指标和药效成分，单萜和倍半萜是高良姜挥发油的主要成分。张春荣等从高良姜根茎中克隆了萜类生物合成关键酶1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶（1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductase，DXR）的全长cDNA（AoDXR）；AoDXR在高良姜叶片中的表达量最强，其次是根，在根茎中的表达量较低，反应了AoDXR催化终产物的多样性和表达调控的复杂性；外源茉莉酸甲酯处理提高了高良姜根茎AoDXR的转录水平和单萜成分1,8-桉油精的含量，对提高药材品质有应用价值[22]。黄琼林等从高良姜转录组数据中得到了2 个倍半萜合成酶（sesquiterpene synthase，SES）基因（AoSES3 和AoSES6），二者在高良姜叶片、茎和根茎中均有表达，AoSES3 在叶片中的表达量最高，而AoSES6 则在根茎中的表达量最高，两者在茎中的表达量均为最低[23]。

黄酮类化合物也是高良姜重要的药效成分。苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase,PAL）是黄酮类化合物生物合成上游途径的关键限速酶。黄琼林从高良姜转录组数据中挖掘到一个AoPALcDNA 序列，在高良姜根茎中的表达量最强，远高于茎和叶中的表达量，与根茎中药效成分含量较高并以根茎部位入药相一致[24]。查尔酮合成酶（chalcone synthase，CHS）是植物黄酮类化合物生物合成途径的第一步关键限速酶。黄琼林从高良姜转录组数据中挖掘到一个AoCHScDNA 序列，在根茎中的表达量最高，其次为茎，最低的是叶片，提示根茎中黄酮类化合物的生物合成较为活跃[25]。

2.2.2 叶绿体基因组结构

叶绿体基因组结构明确，序列相对保守，在物种形成和进化中发挥着关键作用，可用于物种鉴定和系统发育关系研究。黄琼林[9]和Yang 等[10]基于第二代测序技术获得了高良姜叶绿体基因组序列。黄琼林获得的高良姜叶绿体基因组全长为162137 bp，编码基因有132 个，包括86 个蛋白质编码基因，38 个tRNA 基因，8 个rRNA 基因[9]。Yang 等获得的高良姜叶绿体基因组长度为162140 bp，编码基因有111 个，包括79个蛋白质编码基因，28 个tRNA 基因，4 个rRNA 基因[10]。Yang 等在高良姜叶绿体基因组中发现了296 个SSR、49 个散在的长重复序列（序列长度≥30 bp 的重复）和28个串联重复序列，可用于高良姜分子标记的开发[10]。

2.2.3 转录组结构

黄琼林基于第二代测序技术对高良姜根茎、茎、叶片等组织进行转录组测序和分析，从高良姜不同组织中共获得147652 条unigenes，53.19%的基因获得功能注释，有589 个unigenes 参与萜类、黄酮类和苯丙素类等次级代谢产物的生物合成[26]。基因表达模式分析表明[27]，差异表达基因主要集中在叶与根茎、茎之间，而根茎与茎之间的差异表达基因较少；挖掘到9个参与萜类生物合成的关键酶基因，这9个基因在根茎中的表达量显著高于叶片，与萜类挥发油在根茎中的含量高于叶片相一致。

3 小结

虽然在高良姜系统进化、遗传多样性、分子鉴定和功能基因组学等领域取得了一定的进展，但目前高良姜分子生药学研究尚处于初步阶段，仍存在许多不足之处：1）揭示了高良姜与其他山姜属植物的系统发育关系，但尚存在与传统形态分类观点不一致的地方，还需要挖掘其他分子标记和分类学方法深入探究姜科植物的系统演化关系。2）发现了不同地区分布或栽培的居群间高良姜遗传多样性较为丰富，而同一地域栽培的局群内高良姜因无性繁殖和种苗的地域内传播导致遗传多样性低；高良姜野生资源濒临枯竭，用于遗传多样性研究的野生样本较少，也缺乏不同高良姜栽培品系间的遗传多样性研究，阻碍了高良姜品种选育进程。3）开发了基于ITS、petN-psbM、psaJrpl33、matK、rbcL 等序列鉴别高良姜及其山姜属混淆品的方法，但尚未开发高良姜特异性PCR 鉴别引物和通用的DNA 条形码序列，尚未建立高效快速的高良姜分子鉴别方法。4）解析了基于二代测序的高良姜叶绿体基因组和营养器官转录组的结构，挖掘到高良姜萜类、黄酮类等活性成分生物合成相关的部分功能基因，并对部分关键酶基因的序列特征和表达模式进行初步分析；尚未发表基于三代测序的全长基因组和转录组结构，挖掘到的与高产优质表型相关的功能基因较少，特别是与药效成分生物合成相关的功能基因缺乏功能验证，限制了高良姜在分子育种和合成生物学领域的发展。

因此，当前亟需利用多组学技术加快高良姜结构基因组学和功能基因组学的研究步伐，完成优质性状关联基因的功能验证和染色体定位，从而为高良姜的分子标记辅助育种、药材生产的环境调控、药效成分的合成生物学生产等实践活动奠定基础。