王文辉,袁文彬,李谨成,杨天旭,邵兰军,谢丹凤,王 维

(1.华南农业大学, 广州 510640;2.广东中烟工业有限责任公司,广州 510610)

【研究意义】烤烟化学成分是品种遗传、生态环境和栽培因素共同作用的结果[1-2],而海拔高度又是影响生态环境的重要因子之一[3-4]。由于海拔高度的变化会导致光照强度、有效积温、空气湿度和降雨量等因子显著变化,从而对烟株的生长发育产生影响,进而影响烤烟的品质。在一定区域范围内,海拔高度与土壤理化性质相比,前者对烤烟常规化学成分和吃味的影响程度远大于后者[5-9]。同时,烟叶的代谢产物与烤烟的风格特征也有着密切关系[10]。因此,明确不同海拔高度烤烟的常规化学成分、感官质量和代谢物的差异以及它们之间的关系对产区布局有重要意义。【前人研究进展】目前,关于海拔高度对烟叶化学成分和吃香味的影响已有相应研究。王正旭等[7]对玉溪烟区海拔高度与烤烟化学成分的研究表明,随海拔升高,烤烟中部叶总氮含量升高,烟碱含量下降,总糖和还原糖含量则呈先增后减趋势。王育军等[11]研究表明,海拔高度与烤烟总糖含量呈显著正相关,与总氮和钾含量呈显著负相关。Li等[10]认为烟叶代谢物表达水平与地理条件有密切关系。杨虹琦等[12]报道了烤烟胡萝卜素含量随海拔升高而升高的趋势,张志逢等[13]研究结果表明优质烟叶中含有大量类胡萝卜素降解产物。在烤烟吃香味方面,前人研究一般认为随着海拔增加,烤烟的香型风格会更趋近于清甜香型[10, 14-15]。【本研究切入点】会理烟区是凉山州烤烟主产区之一,光资源丰富,降水充沛,其生态环境造就了该烟区烤烟清香型风格突出、配伍性强的特点[16]。会理烟区常年烟叶收购量在3.0×107～3.5×107kg,但由于会理烟区海拔跨度较大,垂直气候明显,导致不同海拔区域的烤烟质量和风格存在较大差异。目前关于海拔高度与烤烟常规化学成分含量和感官质量的研究较多,但对不同海拔高度的烤烟代谢组学研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】本研究从烤烟化学成分、感官质量和代谢组学方面入手,分析了海拔高度与烤烟质量、风格和代谢物质的关系,为进一步促进产区合理布局和工业企业对产区烟叶原料的精准使用提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料

于2020年在会理县境内,依据当地地形地貌,沿同一坡向,选取有代表性的植烟自然村作为取样点进行取样。取样品种均为当地主栽品种云烟87,等级为中桔三(C3F),每份烟样3 kg,植烟土壤均为紫色土,各取样点烟叶生产管理措施均参照凉山彝族自治州优质烟叶生产技术标准执行。取样信息见表1,取样海拔1554～2248 m,将所有样本分成3个海拔区间,平均海拔分别为1709.39、1894.14和2140.00 m,以Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ分别代表上述海拔高度。

表1 烤烟取样信息

1.2 测定指标及方法

1.2.1 常规化学成分测定 总糖和还原糖含量采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定[17];总氮、烟碱、钾、氯和石油醚提取物含量分别按照标准YC/T 161—2002、YC/T 34—1996、YC/T 173—2003、YC/T 153—2001和YC/T 176—2003进行测定。并用推算法得出氮碱比、糖碱比、钾氯比及两糖比。

1.2.2 感官质量评价 感官和外观质量评价工作均由广东中烟工业有限责任公司技术中心组织技术人员进行。将所取烟样按照标准GB/T 16447—2004平衡水分,然后依据标准GB/T 2635—1992进行外观质量评价,之后将烟样切丝并制成单料卷烟,用于感官质量评价,各感官质量评价指标满分均为9分。

1.2.3 代谢组测定 由于海拔高度临近的样本间海拔无明显界限,若直接对各样本进行代谢组测定,可能导致样本组间变异度不高,组内不聚集,分析效果差。基于此,在每个海拔区间各取等量烟末充分混合,对混合样进行非靶向代谢物质测定。称取约1.0 g烟末混合样本,6个重复,将其转移至20 mL顶空进样瓶中,在60 ℃恒温条件下,震荡15 min,震荡速度为450 r/min(5 s开,2 s关),50/30 μm DVB/CAR on PDMS萃取头插入样品顶空部分,顶空萃取60 min,于250 ℃下解析5 min,然后进行GC-MS分离鉴定。色谱条件:DB-WAX毛细管柱,载气为高纯氦气,恒流流速1.0 mL/min,进样口温度260 ℃,不分流进样,溶剂延迟1.5 min,程序升温:40 °C保持3 min,以5 °C/min升至220 °C,保持5 min。质谱条件:电子轰击离子源(EI),离子源温度230 ℃,四级杆温度150 ℃,电子能量70 eV。扫描方式为全扫描模式(SCAN),质量扫描范围:20～650 m/z。

1.3 数据分析

实验数据运用Excel 2016进行初步处理,通过Sminc 14.1对代谢组数据建模,用SPSS 26和Origin 2021对数据进行统计分析及绘图。

2 结果与分析

2.1 海拔高度对烤烟常规化学成分的影响

由表2可知,烤烟总糖、还原糖和石油醚提取物含量随海拔升高而升高,烟碱和总氮含量则与之相反。对于各海拔间的化学成分协调性而言,仅糖碱比指标的差异达显著水平,表现为随海拔升高,糖碱比增大。

表2 海拔高度对烤烟常规化学成分的影响

2.2 海拔高度对烤烟感官质量的影响

如图1所示,在质量指标方面,随着植烟海拔的升高,显著改善了烤烟的香气质、增加了香气量,杂气也有所减轻。对于烤烟风格特色及香韵指标而言,低海拔的烤烟清甜香和青香香韵强度较弱;高海拔的烤烟清甜香型风格更突显,但劲头显著减小。

图1 海拔高度对烤烟感官质量的影响Fig.1 Effect of altitude on the sensory quality of flue-cured tobacco

2.3 海拔高度与烤烟化学成分和感官质量指标的相关性

由表3可知,糖碱比的相关系数绝对值最大,说明其与海拔的相关性最强;总糖、还原糖和糖碱比均与海拔高度极显著相关,呈强正相关;清甜香型风格彰显度与海拔高度极显著相关,呈中等程度正相关,烟碱和总氮则与之相反;石油醚提取物、香气质、香气量、杂气、清甜香香韵强度和劲头虽然均与海拔高度呈显著或极显著相关,但相关系数绝对值较小,相关性较弱。

表3 烤烟质量指标与海拔高度的相关性

2.4 海拔高度导致烤烟代谢组学的差异

2.4.1 代谢物的PCA及OPLS-DA分析 为进一步研究各海拔烤烟在代谢水平是否存在差异,对不同植烟海拔的烤烟进行GC-MS分析,共定性得到626个代谢物。主成分分析(PCA)是一种无监督的分析方法[18],因其无外加人为因素干扰,得到的PCA模型能够反映数据的原始状态, 通过对各样本数据进行PCA分析,可以判断样本组间与组内的变异程度大小[19],因此选择PCA对代谢组学数据进行初步观测。如图2所示,样本被明显分成3组,不同海拔的样本组间分离,组内聚集,表明样本组内差异较小,而组间差异较大,说明海拔高度对烤烟代谢物的影响较大,实验重复性好。

图2 PCA得分Fig.2 PCA score

正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)是一种有监督的分析方法,采用正交信号校正原理建立代谢物表达量与样本类别之间的关系模型[19]。如图3所示,各分组样本完全分离,进一步说明不同海拔高度的烤烟代谢物存在较大差异。在OPLS-DA置换检验图中(图4),200次随机分组Q2点均低于最右侧原始分组的Q2点,且Q2回归线的截距为-0.708,小于0,表明模型未过拟合,结果可靠。

图3 OPLS-DA得分Fig.3 OPLS-DA score

图4 OPLS-DA 200次置换检验Fig.4 OPLS-DA 200 permutations test

2.4.2 差异代谢物分析 VIP值为OPLS-DA第一主成分变量的重要性投影。OPLS-DA载荷图展示各代谢物与主成分之间的相关关系,代谢物散点越偏移原点,说明该代谢物对原变量的解释贡献度越大[10]。以VIP值大于1且离原点距离大于0.9为筛选条件,在图5-a载荷图中标记满足筛选条件的28种差异代谢物。如图5-b所示,新植二烯和烟碱VIP值为11.75和10.55,明显高于其余差异代谢物,其中新植二烯的表达量随着海拔升高而显著增加,烟碱则与之相反。

图5 OPLS-DA载荷图及差异代谢物VIP值Fig.5 OPLS-DA loading plot and VIP values of differential metabolites

从代谢物聚类结果(图6)看,各海拔烤烟的代谢物相对含量有较大差异。在欧式平方距离4处,可将所有差异代谢物分为3类,包含烟碱及与烟碱合成密切相关的烟酸和麦斯明在内的第一类代谢物在低海拔地区烤烟中的相对含量最高,这些代谢物中包括氮杂环类物质3种,酮类2种,烃类1种;第二类代谢物在中海拔地区的烤烟中相对含量较高,其中酸类物质5种,酮类和酯类物质各1种;第三类以醇类和酮类物质居多,共包含15种代谢物,在高海拔地区的烤烟中相对含量最高,其中包含醇类物质6种,酮类4种,酯类2种,烃类、醛类和氮杂环类各1种。在这些物质中,新植二烯、二氢大马酮、大马酮、β-紫罗兰酮和二氢猕猴桃内脂均属于质体色素降解产物,苯甲醇和苯乙醇属于苯丙氨酸降解产物。

图6 差异代谢物聚类热图Fig.6 Cluster heatmap of different metabolites

2.4.3 代谢物的代谢途径和富集分析 如图7-a所示,28个差异代谢物被注释到碳水化合物代谢、氨基酸代谢、萜类和聚酮化合物代谢、能量代谢、辅因子和维生素代谢和其它次生代谢物生物合成6条B级代谢通路,其中被标注到碳水化合物代谢和氨基酸代谢中的C级代谢通路较多,共15条。图7-b显示被注释到的20条C级代谢通路富集情况,其中丙酮酸代谢富集了3个代谢物,且通路差异最显著;丁酸代谢、烟碱和烟酰胺代谢、乙醛酸和二羧酸代谢和托烷、哌啶和吡啶生物碱生物合成分别富集了2个代谢物,其余代谢通路均分别富集到1个代谢物。功能注释和富集分析结果表明,海拔高度的变化主要影响烟叶的碳水化合物代谢和氨基酸代谢,其中对碳水化合物代谢中的丙酮酸、丁酸、乙醛酸和二羧酸等代谢C级通路影响最显著。

图7 差异代谢物的KEGG代谢通路和富集Fig.7 KEGG metabolic pathway and enrichment of different metabolites

3 讨 论

不同海拔高度造就了不同的生态环境,进而造成烤烟化学成分的差异[7]。本研究对不同海拔高度烤烟的化学成分进行分析,结果表明,较高的植烟海拔更有利于烤烟总糖和还原糖的积累,烟碱和总氮则与之相反,导致烤烟的糖碱比随海拔升高而显著上升。但王彪等[20]研究发现,海拔高度与烤烟的还原糖含量呈负相关,与烟碱含量呈正相关,与本研究结果相反,这可能是由于研究的海拔区间不一致所致。由于会理烟区海拔落差大,高海拔地区太阳辐射强度高、气温较低且昼夜温差较大,有利于糖类的合成和积累,同时较低温度也可能导致烟碱合成酶活性下降,降低了烟碱合成速度,从而使得高海拔地区的烤烟呈现出高糖碱比的特征,而糖碱比与清甜香型风格彰显度呈显著正相关[21-22],因此较高糖碱比可能是会理高海拔地区烤烟清甜香型风格更突出的原因之一。刘浩等[23]研究显示,红壤土速效钾及烤烟钾含量与海拔高度呈极显著正相关,但本研究结果显示钾含量与海拔高度相关性不大,这可能是因为紫色土速效钾含量随海拔高度的变化规律与红壤土不尽相同导致。王正旭等[7]研究表明,烤烟氯含量受海拔高度的影响不大,这与本研究一致。

GC-MS是分离和测定代谢物的常用方法,Li等[10, 24-25]研究发现,地理环境的差异会造成气候因素显著变化,诸如酚类、有机酸类、糖类和氨基酸等烟叶代谢物表达水平与气候因素的关系非常密切。本研究通过对不同海拔的烤烟进行GC-MS分析,共定性到626种代谢物,最后筛选出对模型贡献率较大的差异代谢物28种,其中以酮类、酸类和醇类最为丰富,属于烃类的新植二烯在差异代谢物中相对含量最高,这一点与已有报道一致[22, 26]。本研究表明,低海拔地区烤烟的差异代谢物中烟碱及与其关系密切的烟酸、麦斯明相对含量最高。由于烟酸和烟酰胺代谢途径中,烟酸是烟碱合成的上游化合物,较高的烟酸含量促进了烟碱的合成,而高烟碱含量又为麦斯明的生成提供更多底物,这可能是低海拔地区烤烟烟碱、烟酸和麦斯明相对含量较高的原因。史宏志等[15]认为降烟碱在烟叶调制过程中容易转化为麦斯明及吡啶化合物等不利成分,影响烟叶的香味品质,同时较高的烟碱含量也不利于烤烟清甜香型风格的形成[10]。本研究结果显示,中海拔地区烤烟相对含量较高的物质以酸类为主。由于烤烟中的挥发性有机酸本身就带有一定的芳香气味,如己酸、异戊酸有奶香味,壬酸有脂蜡香味等[15],因此挥发性有机酸在烤烟抽吸过程中可直接进入烟气,对烟气香味有明显的影响[27],但史宏志等[28]认为烤烟的有机酸含量过高可能使得烟气在吸食过程中对喉咙产生辛辣灼烧感。高海拔地区烤烟以醇类和酮类相对含量最高,其中新植二烯、二氢大马酮、大马酮、β-紫罗兰酮和二氢猕猴桃内脂均属于质体色素降解产物。类胡萝卜素降解产生的香气物质域值低、香气质较好,对烤烟香气贡献率较大,如大马酮可显著提高烟气香气质量、增加清香香味,β-紫罗兰酮有果香香味等[15, 29];叶绿素降解产物新植二烯本身就具有清香气味,且刺激性小,具有醇和烟气和减小刺激性的作用[15]。由于类胡萝卜素具有重要的光保护生物功能,抑制多种活性氧的形成[30],而高海拔地区光辐射强度高且温度低,质体色素降解速率较低,因此该地区的烟叶可能拥有更多的类胡萝卜素和叶绿素含量[31],为烟叶在成熟和调制过程产生更多质体色素降解产物提供了物质基础,这可能是高海拔地区烤烟类胡萝卜素降解产物较丰富的重要原因。本研究的代谢通路功能注释和富集分析表明,海拔高度主要影响烟叶的碳水化合物代谢和氨基酸代谢。Hu等[32]研究发现低温下碳水化合物代谢和氨基酸代谢对烟草细胞环境的建立起重要作用。高海拔地区气温较低,植物细胞中氨基酸生物合成水平的提高与增强抗逆境能力相关[33],碳水化合物代谢又为氨基酸代谢提供大量能量,这可能是植烟海拔发生变化后,碳水化合物代谢和氨基酸代谢变化最明显的原因。

烤烟的感官质量评价结果显示,随着海拔升高,烤烟的香气质改善、香气量增加、杂气增加、清甜香型风格更典型,但劲头有所降低。高海拔地区的烤烟烟碱含量低、糖碱比相对较高,同时醇类和一些质体色素降解产物表达水平较高,改善了挥发性代谢物之间的协调性,从而导致高海拔地区烤烟吃香味更好,并强化了其清甜香型风格。

4 结 论

对于常规化学成分而言,随着海拔升高,烤烟总糖和还原糖含量显著增加,烟碱和总氮含量显著下降,导致糖碱比增大。GC-MS分析结果显示,低海拔地区烤烟的烟碱和与其关系密切的烟酸、麦斯明表达量较高;中海拔地区烤烟的有机酸类物质含量最丰富;高海拔地区烤烟的醇类和一些质体色素降解产物表达水平最高。代谢通路功能注释和富集分析表明,海拔高度主要影响烟叶的碳水化合物代谢和氨基酸代谢。烟样的感官质量评价结果表明,相较于中低海拔,高海拔地区的烤烟香气质有所改善、香气量增多、杂气减轻且清甜香型风格更突出。适当提高会理烟区植烟海拔有利于提升产区烤烟的质量和强化其清甜香型风格。