王万坤,康 超,曾维军,郑 旋,杨 玲,刘忠玄,王 芳,王 晶

(贵州省生物研究所,贵阳 550009)

【研究意义】冬荪别名竹下菌、竹菌和无裙荪等,属鬼笔目(Phallales)鬼笔科(Phallaceae)鬼笔属(Phallus)真菌,是一种珍稀食药用菌,其子实体具有活血止痛、祛风除湿及抗癌等功效[1-2]。冬荪是可食用鬼笔属真菌统称,常包括白鬼笔(P.inpudicus)、冬荪(P.dongsun)、香笔菌(P.fragrans)、重脉鬼笔(P.costatus)等[3]。冬荪作为贵州地理标志产品,是贵州特色食用菌的重要支柱,栽培面积最多为白鬼笔和冬荪。作为典型覆土食用菌,其生长受土壤类型、土壤环境、栽培模式等影响,探究不同土壤环境及栽培周期内覆土层土壤微生物群落特征,对实现其保产增产、提质增效具有重要意义。【前人研究进展】土壤微生物作为生态系统的重要组成,直接或间接地参与土壤物质循环、能量转换等过程[4]。土壤微生物的代谢功能受土壤微生物种群、土壤动植物以及周围土壤环境影响[5],对土壤理化性质、酶活、维护生态平衡发挥了巨大作用[4]。覆土食用菌的生长受土壤微生物、理化性质、酶活等影响,土壤微生物对食用菌原基的形成具有重要作用[6]。熊川等[7]研究认为,羊肚菌菌塘土壤细菌群落结构的丰富性有利于羊肚菌生长,羊肚菌生长需土壤中相关微生物或某些特殊物质的刺激。王琳等[8]研究表明,在覆土层中添加恶臭假单胞菌,可促进双孢蘑菇菌丝的生长和扭结,产量提高24.9%。土壤微生物种类、数量与覆土食用菌之间必须保持动态平衡,才有利于双方的生长。吴红萍等[9]认为,熟料作为竹荪栽培料,可相对减少覆土层土壤微生物多样性和土壤微生物对营养、水分和空间的竞争,为菌丝生长、繁殖提供更多的营养和适宜的土壤微环境。苏德伟等[10]研究表明,覆土食用菌生长能改变覆土层土壤微生物群落多样性,竹荪栽培不同时期土壤中的细菌、真菌、放线菌的数量依次增加,其中细菌占比达99.75%,同时也改变了土壤pH、氮、磷、钾等含量及土壤酶活性和肥力等。詹颖馨等[11]对卵孢长根菇覆土层微生物群落结构进行研究表明,覆土层真菌物种数量在采收期达最大值,细菌物种数量则随着卵孢长根菇的生长不断下降,而病害的发生则造成土壤微生物种类和丰度降低,土壤营养元素消耗,pH降低。连作障碍普遍存在于各类作物中,也是导致土壤微生物多样性变化的原因之一,吕杨兰[12]研究表明,竹荪连作导致土壤微生物数量、脲酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶、蛋白酶等发生变化,从而影响竹荪正常生长和产品质量。【本研究切入点】土壤微生物、理化性质对覆土食用菌的生长及子实体形成有明显作用,但未见贵州冬荪覆土微生物多样性的相关研究。【拟解决的关键问题】采集贵州冬荪主要种植地区不同土壤环境和不同生长期土壤样品,采用高通量测序技术,分析不同土壤环境冬荪覆土层土壤微生物群落组成、多样性等结构特征和土壤理化性质变化,研究覆土层微生态各因素间相互关系,探究冬荪整个生长期微生物变化规律,为冬荪高效栽培提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种 冬荪(P.dongsun)为贵州当地品种,由贵州省生物研究所提供。

1.1.2 试剂 FastDNA®Spin Kit for Soil DNA抽提试剂盒(MP Biomedicals,美国),agArose琼脂糖(biowest,西班牙),FastPfu Polymerase(TransGen,中国),AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen,美国),NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit建库试剂盒(Bioo Scientific,美国),MiSeq Reagent Kit v3测序试剂盒(Illumina,美国),土壤基本营养指标检测的相关试剂(分析纯)均购置于成都金山化学试剂有限公司。

1.1.3 仪器 Eppendorf 5424R型高速冷冻离心机(Eppendorf,德国),NanoDrop2000型超微量分光光度计(Thermo Fisher Scientific,美国),BioTek®ELx800型酶标仪(Biotek,美国),TL-48R型粉碎研磨仪(上海万柏生物科技有限公司,中国),FastPrep-24 5G型MP研磨仪(MP,美国),iCETM3500 AAS 原子吸收光谱仪(Thermo Fisher Scientific,美国),Kjeltec 8400型全自动凯氏定氮仪(FOSS,丹麦)QuantusTMFluorometer型微型荧光计(Promega,美国),ABI GeneAmp®9700型PCR仪(ABI,美国),Miseq测序仪(Illumina,美国)。

1.2 试验地概况

试验在贵州省大方县进行,试验地及土壤类型分别为林下壤土、耕地壤土和耕地沙质土。林下壤土试验地海拔1766 m,种植前土壤碱解氮含量123.89 mg/kg,有效磷含量4.3 mg/kg,速效钾含量61 mg/kg,有机质含量122.23 g/kg,pH 4.78;耕地壤土试验地海拔1259 m,种植前土壤碱解氮含量76.35 mg/kg,有效磷含量31.46 mg/kg,速效钾含量217 mg/kg,有机质含量107.54 g/kg,pH 7.27;耕地沙质土试验地为冬荪连作第2年土壤,海拔1254 m,种植前土壤碱解氮60.50 mg/kg,有效磷97 mg/kg,速效钾148 mg/kg,有机质103.51 g/kg,pH 8.28。

1.3 试验方法

1.3.1 土壤样品采集 2021年3月,参考肖艳等[13]的方法将冬荪种植于林下壤土、耕地壤土和耕地沙质土中,试验地面积均为0.67 hm2。土壤样品采集于2021年4月(即冬荪栽培前期,E)、6月(菌丝生长期,M)、9月(菌蕾生长期,B)、11月(子实体生长期,F)和12月(子实体衰败期,D),每个样点随机设置20 m×20 m样方,5点取样法取样,去除表层土(5 cm左右),钻取冬荪菌丝覆土层土壤(5 cm土层)并混合,将土样过2 mm筛网去杂质,分别保存于4和-80 ℃冰箱中,用于土壤理化性质和土壤DNA测定分析。

1.3.2 土壤基础营养指标测定 土壤全氮、全磷、全钾、有效磷、速效钾、有机质、pH分别按NY/T 53—1987、GB/T 9837—1988、NY/T 87—1988、NY/T 1121.7—2014、NY/T 1849—2010、NY/T1121.6—2006、NY/T 1241—1999中的相应方法进行测定;土壤碱解氮按《土壤学实验》中的碱解扩散法进行测定[14]。

1.3.3 DNA提取和PCR扩增 根据FastDNA®Spin Kit for Soil DNA抽提试剂盒(MP Biomedicals,美国)说明书逐步进行土样微生物群落总DNA抽提,使用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量,使用NanoDrop 2000测定DNA浓度和纯度。以提取的总DNA为模板,用细菌通用引物338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT) 对16S rRNA基因V3～V4可变区进行PCR扩增,用真菌通用引物ITS1F(CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA)和ITS2R(GCTGCGTTCTTCATCGATGC)对ITS1基因进行扩增。扩增程序:95 ℃预变性3 min,35个循环(95 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s),72 ℃稳定延伸10 min,最后10 ℃进行保存(PCR仪:ABIGeneAmp®9700型)。338F-806R引物PCR反应体系为:5×FastPfu Buffer缓冲液4 μL,2.5 mmol/L dNTPs 4 μL,上游引物(5 μmol/L)0.8 μL,下游引物(5 μmol/L)0.8 μL,FastPfu Polymerase DNA聚合酶0.4 μL,BSA 0.2 μL,模板DNA 10 ng,ddH2O补足至20 μL。ITS1F-ITS2R引物PCR反应体系为:10×Buffer缓冲液2 μL,2.5 mmol/L dNTPs 2 μL,上游引物(5 μmol/L)0.8 μL,下游引物(5 μmol/L)0.8 μL,rTaq聚合酶0.2 μL,BSA 0.2 μL,模板DNA 10 ng,ddH2O补足至20 μL。

1.3.4 Illumina Miseq测序 将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物,用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences,美国)纯化回收产物,2%琼脂糖凝胶电泳检测,并用QuantusTMFluorometer(Promega,美国)对回收产物进行检测定量。使用NEXTflexTM Rapid DNA-Seq Kit(Bioo Scientific,美国)建库:①接头链接;②使用磁珠筛选去除接头自连片段;③利用PCR扩增进行文库模板的富集;④磁珠回收PCR产物得到最终的文库,将DNA样品委托上海美吉生物医药科技有限公司进行MiSeq高通量测序。

1.4 数据处理

数据采用SPSS Version 22进行统计分析。使用Uparse 7.0.1090进行OTU分析和Pan分析,聚类方式采用USEARCH7-uparse算法,OTU序列相似度为0.97,物种分类数据库为unite 8.0/its_fungi,分类置信度为0.7。使用mothur v.1.30.2计算Shannon指数,并对组间Shannon指数差异进行t检验。使用R语言3.3.1制作物种Venn图、群落柱形图、相关性Heatmap图,使OriginPro 2021软件绘制折线图和柱状图。

2 结果与分析

2.1 冬荪栽培不同土壤环境的理化性质

从图1看出,全氮、碱解氮含量耕地壤土和沙质土呈先升后降趋势,林地壤土则呈先升后降再升的趋势,3种土壤环境中的全氮、碱解氮含量最高值均处于菌丝生长期(M)和菌蕾生长期(B),并以林地壤土含量最高;不同土壤环境的全钾含量在整个生长周期变化不明显,速效钾与全钾含量变化趋势无一致性,耕地壤土、林地壤土均呈先升后降趋势,耕地沙质土则呈先升后降再升趋势,整个过程中林地壤土全钾及速效钾含量最低;不同土壤环境全磷含量均呈先升后降趋势,整个栽培周期内耕地沙质土全磷和有效磷最高,林地壤土最低;土壤有机质含量耕地壤土和沙质土均呈先升后降趋势,林地壤土则呈先升后降再升趋势,林地壤土和耕地壤土变化明显,以菌丝生长期(M)和菌蕾生长期(B)最高;土壤pH耕地壤土呈下降趋势,耕地沙质土呈先降后升再微降趋势,林地壤土呈先降后升再降趋势,其中,林地壤土pH偏酸性,耕地壤土中性偏酸,耕地沙质土中性偏碱性。表明,在冬荪菌丝生长期和菌蕾生长期,土壤中全氮、全磷、碱解氮,速效钾、有效磷、有机质均明显增加并达最大值,全钾则降低,pH在整个栽培周期均呈下降趋势。

图1 不同土壤环境及冬荪菌丝生长期内土壤的理化性质Fig.1 Soil physiochemical properties under different soil environment and during mycelial growth state of P.dongsun

2.2 冬荪栽培不同土壤环境中细菌和真菌物种的多样性

对土样中细菌和真菌进行DNA抽取,高通量分析后获得9367个细菌物种OTU,属于43个门1024个属,总序列数831 316条,各样本序列数范围为55 229～78 458条,序列平均长度为415 bp;获得5851个真菌物种OTU,属于16个门891个属,总序列数2012 901条,各样本序列数范围为53 244～124 196条,序列平均长度为231 bp。由图2可知,耕地壤土、耕地沙质土的土壤细菌Shannon指数显著高于林地壤土(P<0.05),耕地壤土与耕地沙质土之间土壤细菌Shannon指数差异不显著,表明冬荪栽培地内耕地壤土和耕地沙质土细菌多样性高于林地壤土;3种土壤间的土壤真菌Shannon指数差异不显著,表明不同土壤环境土壤真菌多样性在栽培期内无明显差异。综合比较,同一土壤环境中细菌多样性高于真菌多样性。

图2 属分类水平下不同土壤环境细菌和真菌的Shannon指数Fig.2 Shannon index of soil bacterial community and fungal community under different soil environments at genus level

2.3 冬荪栽培不同土壤环境中细菌和真菌物种的组成

2.3.1 门水平下物种的相对丰度 由图3可知,在细菌门水平下,变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteriota)、酸杆菌门(Acidobacteriota)和绿弯菌门(Chloroflexi)为冬荪栽培地覆土层的优势门类,其相对丰度总和在林地壤土、耕地壤土、耕地沙质土中分别达83.80%、84.44%、80.13%。在真菌门水平下,子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)和被孢霉门(Mortierellomycota)为冬荪栽培地覆土层土壤优势门类,其相对丰度总和在林地壤土、耕地壤土、耕地沙质土中分别达85.49%、91.79%和94.96%。

图3 门水平下不同土壤环境中细菌和真菌物种群落的相对丰度Fig.3 Relative abundance of bacterial phyla and fungal phyla under different soil environment at phylum level

2.3.2 属水平下物种的相对丰度 从图4看出,细菌属水平下相对丰度>1%的共有40个属,林地壤土样地中热酸菌属(Acidothermus)和norank_f_norank_o_Subgroup_2相对丰度较高,分别占该组物种总数7.60%和7.32%;耕地壤土和耕地沙质土样地中,norank_f_norank_o_Vicinamibacterales和norank_f_Vicinamibacteraceae属丰度占比较高,分别占该组物种总数5.22%、3.87%和3.37%、3.62%。表明,冬荪栽培地覆土层林地土壤和耕作土壤(包括壤土和沙质土)细菌高丰度物种存在明显差异。真菌属水平下相对丰度>1%的共有38个属,其中林地壤土样地相对丰度居前5的分别为被孢霉属(Mortierella)、unclassified_c_Archaeorhizomycetes、沙蜥属(Saitozyma)、unclassified_k_Fungi和Archaeorhizomyces,分别占该组物种总数的10.42%、25.41%、11.36%、9.37%和9.97%;在耕地壤土分组中相对丰度居前3的物种分别是被孢霉属(Mortierella)、沙蜥属(Saitozyma)和鬼笔属(Phallus),分别占该组物种总数14.24%、7.18%和7.37%;在耕地沙质土分组相对丰度居前3的物种分别是被孢霉属(Mortierella)、篮状菌属(Talaromyces)和鬼笔属(Phallus),分别占该组物种总数13.61%、5.23%和5.58%。

图4 属水平下不同土壤环境中细菌和真菌物种的相对丰度Fig.4 Relative abundance of bacterial and fungal species under different soil environment at genus level

2.3.3 真菌和细菌的非度量多维尺度(NMDS)分析 从图5可知,各个土壤环境中真菌和细菌样本基本汇聚在一起,表明不同土壤环境之间物种组成差异较大,而同一样地不同时期采集土样也未集中,彼此之间距离较大,表明不同时期内样本细菌物种差异较大。细菌分组样品之间彼此无交集,表明彼此之间无相似物种,NMDS分析的胁强系数stress<0.05,说明NMDS分析对细菌分组土样具有很好代表性。真菌分组样品之间同一样地不同时期采集土样仅林地壤土样地相对集中,耕地壤土和耕地沙质土组内物种差异较大,且耕地壤土与耕地沙质土部分交叉,表明两组间样地真菌物种存在相似性;NMDS分析的胁强系数stress<0.1,说明NMDS分析对真菌分组土样具有较好代表性。

图5 不同土壤环境中细菌和真菌属分类水平的非度量多维尺度分析Fig.5 NMDS analysis of bacterial genus and fungal genus under different soil environment

2.3.4 主要真菌和细菌物种的差异性 细菌。对林地壤土、耕地壤土、耕地沙质土土壤细菌优势属进行组间差异分析,前10个属的物种丰度在不同分组处理之间呈显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)差异(Kruskal-Wallis秩和检验)(图6-a)。在前10个属中,除热酸菌属(Acidothermus)和慢生根瘤菌属(Bradyhizobium)外,其他种类暂无明确分类地位,因此考察这2个属在3个分组之间的差异性。从图6-b看出,林地壤土中热酸菌属(Acidothermus)丰度明显高于耕地壤土和耕地沙质土(P<0.01),耕地壤土与耕地沙质土之间差异不明显;从图6-c看出,林地壤土中慢生根瘤菌属(Bradyhizobium)丰度明显高于耕地沙质土(P<0.01)和耕地壤土(P<0.05),耕地壤土与耕地沙质土之间物种差异极显著(P<0.01)。

*和**分别表示差异显著(P<0.05)和极显著(P<0.01),下同。* and * * indicate significant difference and extremely significant difference at P< 0.05 and P< 0.01 level, respectively.The same as below.图6 不同土壤环境中细菌属主要物种的差异显著性Fig.6 Significant difference of main species of soil bacterial under different soil environment

真菌。从图7-a看出,林地壤土、耕地壤土、耕地沙质土真菌优势属前10个属物种丰度在不同分组处理之间有显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)差异。前10个属物种中,除沙蜥属(Saitozyma)、Archaeorhizomyces、镰刀菌属(Fusarium)、小不整球壳属(Plectosphaerella)、Gibellulopsis、和赤霉菌属(Gibberella)外,其他种类暂无明确分类地位,研究主要考察冬荪栽培与覆土层微生物多样性之间的关系,因此主要分析沙蜥属(Saitozyma)、Archaeorhizomyces、镰刀菌属(Fusarium)及鬼笔属(Phallus)在3个分组之间的物种丰度差异。从图7-b看出,林地壤土与耕地沙质土间沙蜥属(Saitozyma)丰度差异显著(P<0.05),耕地壤土与耕地沙质土之间差异不显著;从图7-c看出,林地壤土中Archaeorhizomyces丰度明显高于耕地壤土、耕地沙质土(P<0.01),耕地壤土与耕地沙质土之间差异不明显;从图7-d看出,耕地沙质土中镰刀菌属(Fusarium)丰度显著高于林地壤土,耕地壤土(P<0.05)、林地壤土与耕地壤土差异不明显,耕地壤土与耕地沙质土之间镰刀菌属(Fusarium)丰度差异显著,从图7-e看出,3个土壤环境覆土层鬼笔属(Phallus)丰度差异不明显。

图7 不同组处理土壤真菌属主要物种差异显著性Fig.7 Significant difference of main species of soil fungal under different treatments

2.4 不同生长期内微生物物种的多样性变化

2.4.1 土壤微生物物种Shannon指数 由图8可知,冬荪栽培地中,不同土壤环境中细菌Shannon指数高于真菌Shannon指数,表明土壤中细菌多样性高于真菌多样性。从不同生长期看,不同土壤环境中真菌Shannon指数均呈先降后升的趋势,但各自变化趋势有差异;细菌Shannon指数耕地壤土和耕地沙质土呈先升后降趋势,林地壤土呈先降后升的趋势。表明,冬荪菌丝不同生长期内林地壤土微生物多样性变化明显,微生物多样性低于耕地壤土和耕地沙质土。

图8 不同冬荪生长期土壤细菌和真菌物种Shannon指数Fig.8 The Shannon index of soil bacterial species and fungal species in different growth periods of P.dongsun

2.4.2 土壤微生物共有物种的丰度差异 从图9看出,冬荪栽培不同生长期内土壤环境中细菌和真菌共有物种前10属丰度有明显差异。林地壤土细菌菌丝生长期(M)热酸菌属(Acidothermus)物种丰度最高,占组内10.07%;耕地壤土细菌norank_f_norank_o_Vicinamibacterales物种丰度占比相对较高,以栽培前期(E)物种丰度最高;耕地沙质土细菌子实体衰败期(D)norank_f_norank_o_Vicinamibacterales物种丰度最高,占组内的9.3%。林地壤土真菌菌蕾生长期(B)以unclassified_c_Archaeorhizomycetes物种丰度最高,占组内的48.05%,其次是菌丝生长期(M),物种丰度达25.4%;鬼笔属(Phallus)随着栽培时间的增加,物种浓度逐渐增加,子实体采收期(F)物种丰度占组内2.78%;耕地壤土真菌子实体生长期(F)鬼笔属(Phallus)物种丰度最高,占组内的28.54%,其次是子实体衰败期(D),物种丰度达18.4%,从整个生长周期看,鬼笔属(Phallus)物种丰度呈先升后降趋势;耕地沙质土真菌子实体生长期(F)篮状菌属(Talaromyces)物种丰度最大,达30.85%,被孢霉属(Mortierella)物种丰度在整个生长周期中占比相对较高,分别为24.82%(E)、17.14%(M)、9.85%(B)、2.36%(F)、13.76%(D);从整个生长周期看,鬼笔属(Phallus)物种丰度呈先升后降趋势,菌蕾生长期(B)物种丰度最大,占11.18%。

图9 不同冬荪生长期土壤微生物共有物种属水平下的特种丰度Fig.9 The abundance of soil microbes from shared species of P.dongsun at genus level

2.5 冬荪栽培不同土壤环境微生物群落和物种与土壤营养的相关性

2.5.1 土壤微生物群落与土壤营养的相关性 考察土壤理化性质与土壤中微生物群落结构关系,为确定共线性较小的环境因子,分别对细菌物种和真菌物种进行VIF方差膨胀因子分析,基于筛选出的主要土壤营养因子进行RDA/CCA分析。RDA分析(图10-a)表明,pH、TP、TK与耕地沙质土细菌群落组成呈正相关,AK、TK与耕地壤土细菌群落组成呈正相关,OM与林地壤土细菌群落多样性呈正相关;TP、TK、AK、AP、pH间呈正相关,与OM之间呈负相关,pH对耕地沙质土细菌群落组成影响最大。CCA分析结果(图10-b)表明,TK与耕地壤土真菌群落组成呈正相关,AP、TP、AK与耕地沙质土真菌群落组成呈正相关,OM与林地壤土真菌群落组成呈正相关;AP、TP、AK、TK间呈正相关,与OM之间呈负相关,TK对耕地壤土真菌群落组成影响最大;环境因子对土壤中鬼笔属物种丰度的影响以土壤全钾最大,且呈正相关。

2.5.2 土壤微生物物种与土壤营养的相关性 由图11-a可知,不同土壤环境中的理化性质指标均与相对基因丰度排名前10的细菌属有相关性,其中有机质与黄杆菌科(Xanthobacteraceae)中无分类属呈正相关(P<0.05),相关系数为57.86%;与芽单胞菌科(Gemmatimonadaceae)、Vicinamibacterales、Vicinamibacteraceae中无分类的属呈负相关(P<0.05);pH、TP、AP与慢生根瘤菌属(Rhizobium)、黄杆菌科(Xanthobacteraceae)、热酸菌属(Acidothermus)及IMCC2625目、AD3纲、Subgroup_2目、Elsterales目中无分类的属呈负相关(P<0.01),相关系数65.36～98.21%;pH、TP、AP、TK、AK与Vicinamibacteraceae中无分类属呈正相关(P<0.05)。从图11-b可知,OM与子囊菌门中不能注释属呈正相关(P<0.05),相关系数54.64%;TP、AP与沙蜥属(Saitozyma)、Archaeorhizomyces及古根菌纲、真菌界中不能注释属呈正相关(P<0.01),相关系数69.90%～91.10%;5个土壤理化因子与鬼笔属物种丰度有一定正相关向,但不显著,表明理化因子对鬼笔属(Phallus)影响不明显。

图11 不同土壤环境微生物物种与土壤营养的相关性HeatmapFig.11 Heatmap of the correlation between soil microbes and soil nutrients under different soil environment

3 讨 论

土壤微生物多样性与一系列生态系统功能(如养分循环、分解和植物生产力)变化呈正相关,是土壤微生物种群、土壤动植物以及周围土壤环境生态相互作用的结果[5],土壤中微生物多样性的变化影响土壤环境中其他微生物群落结构、自身理化性质及相关酶活性变化[4]。本研究中,在冬荪菌丝生长期和菌蕾生长期,土壤中碱解氮、速效磷、有机质含量明显增加,速效养分含量提升,肥力提高,与白莹等[15-16]研究结果一致;全氮、全磷、有效磷亦明显增加,pH在整个栽培周期均呈下降趋势,这与苏德伟等[10]的研究一致,但本研究发现,不同土壤环境pH不同,林地壤土偏酸性,耕地壤土中性偏酸,耕地沙质土中性偏碱性,其差异应该来源土壤环境的不同。相关性分析发现,有机质与林地壤土微生物呈正相关,但与鬼笔属物种变化呈负相关,全磷、全钾、速效钾则与鬼笔属(Phallus)物种丰度呈正相关,但不显著,表明全磷、全钾、速效钾对鬼笔属(Phallus)(冬荪)菌丝的生长有一定促进作用。

外源微生物对土壤本底微生物多样性有明显影响,可改变其群落结构及其生长轨迹,且与外源微生物的种类和数量呈正相关[17]。在冬荪栽培样地内,耕地(壤土和沙质土)细菌Shannon指数显著高于林地壤土,真菌Shannon指数差异不显著,但从趋势上看,林地壤土真菌Shannon指数依然最低,表明冬荪栽培林地壤土微生物多样性低于耕地。从冬荪栽培周期看,在菌丝生长期至子实体生长期,耕地土壤(壤土和沙质土)中细菌Shannon指数明显增加,真菌Shannon指数明显降低,与前人研究结果相似。如添加枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、伯克氏菌、氧化节杆菌、耳葡萄球菌、嗜麦芽窄食单胞菌等处理后,土壤细菌多样性明显提高[10, 15, 18-20],而真菌多样性降低[21]。詹颖馨等[11]则发现,细菌物种数量随着长根菇的生长不断下降,推测为栽培或添加物种种类不同,导致土壤微生物多样性变化。本研究发现,林地壤土中细菌和真菌多样性呈先降后升的趋势,与耕地土壤环境变化趋势不一致,有待进一步验证。

对不同土壤环境冬荪覆土层微生物主要细菌物种进行分析,林地壤土细菌主要物种为热酸菌属(Acidothermus),耕地壤土为Vicinamibacterales目,耕地沙质土为Vicinamibacteraceae科,属水平下真菌主要有沙蜥属(Saitozyma)、Archaeorhizomyces、镰刀菌属(Fusarium)、小不整球壳属(Plectosphaerella)、Gibellulopsis和赤霉菌属(Gibberella)。针对具有明确分类地位细菌和真菌物种丰度进行差异性分析,林地壤土覆土层中热酸菌属(Acidothermus)、沙蜥属(Saitozyma)、Archaeorhizomyces丰度高,差异显著,耕地沙质土中镰刀菌属丰度高,差异显著,3种土壤环境覆土层鬼笔属丰度差异不明显。热酸菌属(Acidothermus)、Archaeorhizomyces以及慢生根瘤菌(Bradyhizobium)均与土壤有机质含量呈正相关。热酸菌属(Acidothermus)是分解有机质、利用碳源的细菌,占细菌总量的20%左右[22],Archaeorhizomyces是常见陆生好气真菌[23],在土壤真菌群落中占比约30%[24],其随水分和孔隙度变化常表现出较高的敏感度[25],慢生根瘤菌(Bradyhizobium)则具有固氮作用[26]。本研究发现,耕地沙质土中镰刀菌属(Fusarium)物种丰度显著增加,而镰刀菌被认为是一类重要植物病原菌类群,具有随着栽植代数增加而显著增加的趋势[27-28],本研究结果与之一致。

4 结 论

冬荪覆土层内变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinomycetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)为优势细菌门,子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、被孢霉门(Mortierellomycota)为优势真菌门,且栽培期内细菌多样性增加,真菌多样性减少。在林地壤土、耕地壤土和耕地沙质土3种不同环境中,林地壤土细菌多样性低于耕地壤土和耕地沙质土,真菌多样性不显著;属水平下,热酸菌属、Archaeorhizomyces、慢生根瘤菌是林地壤土优势属,镰刀菌属是耕地壤土连作优势属,均与土壤有机质含量呈正相关。相关分析表明,全磷、全钾、速效钾与鬼笔属(冬荪)物种丰度呈正相关,但不显著,全磷、全钾、速效钾对鬼笔属(冬荪)菌丝生长有促进作用。