姜世丹,李璐茜,潘 俊,唐美玲,朱泽娇,胡 瑜,李益盛,曲 媛

(1.昆明理工大学生命科学与技术学院,昆明 650500;2.云南省农业科学院农产品加工研究所,昆明 650221)

1 材料与方法

1.1 试验动物与细胞株

SPF级昆明小鼠,体重18～22 g,雌雄均匀,于湖南长沙市天勤生物技术有限公司[动物许可证号SCXK(湘)2014-0011]采购。小鼠巨噬细胞株 RAW264.7 购自中国科学院昆明细胞库。DMEM培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司;CCK-8试剂盒购自上海碧云天公司;脂多糖(LPS)购自北京索莱宝科技有限公司;NF-κB、p-NF-κB、IκB-α、β-actin抗体均购自英国Abcam公司;BCA蛋白定量试剂盒购自北京兰杰柯科技有限公司;TNF-α ELISA试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司;ECL显影试剂盒和NO试剂盒均购自南京建成生物科技有限公司。其他所有试剂均为国产分析纯。

人参、三七、西洋参、珠子参、竹节参及屏边三七于2017年10月分别采集或购买于黑龙江抚松市、云南省文山市、美国威斯康星州、云南省丽江市、四川省乐山市及云南省屏边县,经昆明理工大学生命科学与技术学院崔秀明研究员鉴定,分别为五加科人参属人参(PanaxginsengC.A.Meyer)的干燥主根、三七(PanaxnotoginsengF.H.Chen)的干燥主根、西洋参(PanaxquinquefoliusL.)的干燥主根、珠子参[PanaxjaplcusC.A.Mey.var.major (Burk.) C.Y.Wu et K.M Feng]的干燥主根及根茎、竹节参(PanaxjaponicusC.A.Mey)的干燥主根及根茎、屏边三七(PanaxstipuleanatusH.T.Tsai et K.M.Feng)的干燥主根及根茎。

1.2 仪器

UPT-I-20T超纯水器(成都超纯科技有限公司);BL10-250A超声清洗机(上海比朗有限公司);AX124ZH型电子分析天平(上海奥豪斯仪器有限公司);TD25-WS 台式低速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)。SW-CJ-ZFD型超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司);CO2培养箱(天美科学仪器有限公司);倒置显微镜(日本奥林巴斯公司);YXQ-LS-100SII灭菌器(上海博讯实业有限公司);全血仪(泰安市康宇医疗器械有限公司)。

1.3 提取物制备

将人参、三七、珠子参、竹节参、西洋参及屏边三七药材分别粉碎,过60目筛。称取6种人参属药材粉末各10 g置于锥形瓶,加入100 mL 70%甲醇,室温下超声提取30 min,离心静置取上清,药渣重复提取2次,合并提取液,减压浓缩分别得到人参、三七、珠子参、竹节参、西洋参及屏边三七提取物[23]。

1.4 体外抗炎活性研究

1.4.1 细胞培养 将RAW264.7细胞用DMEM高糖完全培养基,在37 ℃、5%CO2培养箱中培养。

1.4.2 细胞活力检测 将RAW264.7细胞以1×105个/mL的密度接种至96孔板中,100 μL/well,设置空白组(培养基)、对照组(细胞+培养基)、LPS组(0.1 g/mL)、6种人参属药材提取物组(0.02、0.20 mg/mL),复孔每组3个,进行药物处理12 h后弃去培养基,CCK-8溶液10 μL/孔,培养箱反应1 h,酶标仪测定吸光度(450 nm)(A)值,计算细胞存活率。

细胞存活率(%)=[(A试验组-A空白组)/(A对照组-A空白组)]×100

(1)

Griess法测定一氧化氮(NO)含量:RAW264.7细胞悬液按照1×105个/mL的密度接种于96孔板,不同浓度(0.02、0.20 mg/mL)的6种人参属提取物处理2 h后,加入LPS孵育12 h,设置对照组(细胞+培养基)、LPS组、L-单甲基-精氨酸(L-NMMA)组、LPS+6种人参属药材提取物组,每组3个复孔,按照Griess试剂盒操作步骤测定NO含量。

ELISA法测定肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量:试验设计与处理同NO含量测定方法。用ELISA法检测6种人参属药材提取物对RAW264.7细胞分泌TNF-α的影响[24]。

1.5 体内抗炎活性研究

1.5.1 6种人参属药材提取物对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响试验 取昆明种小鼠150只,适应性喂养3 d。随机分15组,每组10只,即对照组、模型组、阳性组(醋酸地塞米松,10 mg/kg);6种人参属药材提取物低、高剂量组(200、400 mg/kg)。每日灌胃给药1次,连续给药14 d,正常对照组和模型组给予相应体积生理盐水。末次给药0.5 h后,除空白组外,其他组使用30 μL二甲苯涂抹小鼠右耳致炎,造成急性耳肿胀模型。1 h后采用颈部脱臼法处死小鼠。沿耳廓将小鼠两耳分别剪下,使用打孔器在两耳相同的位置打下圆耳片,精密称重(mg),计算小鼠耳肿胀度和肿胀抑制率。

肿胀度(mg)=致炎后右耳片质量(mg)-左耳片质量(mg)

(2)

抑制率(%)=(模型组耳肿胀度-给药组耳肿胀度)/模型组耳肿胀度×100

(3)

1.5.2 苏木精-伊红(HE)染色法观察小鼠右耳组织病理学变化试验 采用HE染色观察,取小鼠右耳组织于10%中性甲醛中固定,经脱水、石蜡包埋、切片、HE染色,在光镜下观察耳病理组织学改变。

1.5.3 Western blot法检测NF-κB信号通路的相关蛋白表达 将细胞以3×106个/well的密度接种至6孔板进行培养。处理结束后。用细胞刮收集细胞,加入50 μL细胞裂解液裂解30 min以提取细胞中的蛋白。将提取的总蛋白进行BCA蛋白定量,定量后根据结果将蛋白浓度调节至相同含量制备上样蛋白。然后使用SDS-PAGE分离蛋白,将分离的蛋白转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脱脂牛奶封闭2 h,再用TBST缓冲液清洗PVDF膜,然后以β-actin作为内参,IκB-α、NF-κB和p-NF-κB在4 ℃孵育过夜。HPR偶联抗体在37 ℃下孵育1 h。最后,采用增强的ECL溶液显示蛋白条带并记录图像,使用Image J软件对收集到的蛋白图像进行处理,定量分析蛋白表达量。

1.6 数据处理与分析

试验结果以Mean ± SD差表示,采用SPSS 19.0统计软件进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 药材的化学成分比较

人参属药材主要包括人参、西洋参、三七、珠子参、竹节参、屏边三七等,各种药材的外观形态差异较大,如图1所示。人参、西洋参和三七的主要成分是原人参二醇型和原人参三醇型四环三萜皂苷;珠子参和竹节参含有四环三萜和五环三萜皂苷;而屏边三七仅含有五环三萜皂苷,如表1所示。人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd为人参和西洋参的主要成分;三七皂苷R1、人参皂苷 Rg1、Re、Rb1、Rd为三七的主要成分;人参皂苷Rb1、人参皂苷Ro、竹节参皂苷Ⅳa是珠子参和竹节参的主要成分;屏边三七R1和R2是屏边三七的主要成分。人参皂苷在人参属药材中的含量有所不同,其中原人参二醇型人参皂苷Rb1的含量,西洋参>三七>人参>竹节参>珠子参;原人参三醇型人参皂苷Rg1的含量,三七>人参>竹节参>西洋参>珠子参。

表1 6种药材中主要成分及其含量分析

a:屏边三七;b:三七;c:珠子参;d:人参;e:西洋参;f:竹节参。a: P.stipuleanatus; b: P.notoginseng; c: P.japlcus; d: P.ginseng; e: P.quinquefolius; f: P.japonicus.图1 药材样品的外观Fig.1 Appearance of six samples

2.2 药材提取物对RAW264.7细胞存活率的影响

试验采用CCK-8法测定了6种人参属药材提取物对RAW264.7细胞活力的影响。如图2所示,6种人参属药材提取物在0.02、0.20 mg/mL浓度下的细胞存活率与对照组相比差异不显著(P>0.5)。

2.3 药材提取物对LPS诱导RAW264.7细胞释放NO的影响

如图3所示,与对照组相比,LPS组RAW264.7细胞分泌的NO含量显著增加(P<0.001)。与LPS组相比,当给药浓度为0.02 mg/mL时,NO合成酶抑制剂L-单甲基-精氨酸(L-NMMA)组、给药屏边三七组、珠子参组、人参组可显著抑制NO的释放量(P<0.05或P<0.01或P<0.001),而三七组、西洋参组、竹节参组与之相比则无显著差异。与LPS组比较,当浓度为0.20 mg/mL时,6种人参属药材提取物对NO的释放均有显著抑制作用(P<0.05或P<0.01或P<0.001)。表明,6种人参属药材提取物对LPS诱导RAW264.7细胞NO的释放均有抑制作用,抑制效果:屏边三七>人参>珠子参>西洋参>竹节参>三七。

与对照组比较,△△△表示 P<0.001;与模型组比较:*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001。下同。Compared with the control group, △△△represents P < 0.001.Compared with model group, * represents P<0.05, ** represents P<0.01, and *** represents P<0.001.The same as below.图3 不同处理细胞NO释放量 Fig.3 NO release from cells under different treatments

2.4 药材提取物对LPS诱导RAW264.7细胞中TNF-α分泌量的影响

如图4所示,与对照组相比,LPS组可显著增加RAW264.7细胞分泌的TNF-α含量(P<0.01)。当给药浓度为0.02、0.20 mg/mL时,6种人参属药材提取物与LPS组相比均可显著降低RAW264.7细胞分泌的TNF-α含量(P<0.01,P<0.001)。

图4 不同处理细胞的TNF-α分泌量Fig.4 TNF-α secretion of cells under different treatments

2.5 药材提取物对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响

如表2所示,与模型组相比,阳性组(地塞米松)可以显著抑制二甲苯诱导的小鼠耳肿胀,抑制率为63.33%(P<0.001)。与模型组相比,6种人参属药材提取物(400 mg/kg)对二甲苯诱导的小鼠耳肿胀均有抑制作用,其中屏边三七组、三七组、西洋参组及竹节参组的抑制率强于阳性组,分别为91.11%、68.89%、82.22%、64.44%。结果显示,6种人参属药材提取物对二甲苯诱导的小鼠耳肿胀具有抑制作用且呈剂量依赖性,其抑制作用强弱为:屏边三七>西洋参>三七>竹节参>人参>珠子参。

表2 6种提取物对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响

2.6 药材提取物对二甲苯致小鼠耳肿胀耳组织病理结构改变的影响

从图5中耳组织HE染色结果可以看出,与对照组相比,模型组小鼠耳组织出现明显真皮结缔组织水肿,间隙增加及炎性细胞浸润。阳性组耳组织结构基本完整,水肿反应较模型组减轻。6种人参属药材提取物组较模型组水肿反应和炎性细胞浸润减少;屏边三七组较其他给药组水肿反应和炎性细胞浸润最轻,与阳性组相近。

a:L-NMMA为阳性对照(20 mg/mL)。a: L-NMMA is the positive control (20 mg/mL). 图6 不同处理细胞中NF-κB信号通路上相关蛋白表达情况Fig.6 Expression of related proteins on signal pathway of NF-κB in cells under different treatments

2.7 药材提取物对LPS诱导RAW264.7细胞中NF-κB信号通路上相关蛋白表达的影响

如图6所示,与对照组相比,LPS模型组p-NF-κB、IκBα蛋白表达升高,而NF-κB蛋白表达变化不大。与LPS组比较,屏边三七组和竹节参组能显著抑制p-NF-κB、IκBα蛋白表达;珠子参组和竹节参组能显著抑制NF-κB蛋白表达。

3 讨 论

炎症是多种细胞因子与趋化因子参与的动态发生过程,同时也伴随一系列基础的生理与病理过程。巨噬细胞是主要的炎性细胞,RAW264.7细胞是单核巨噬细胞的种类之一,是机体免疫过程中的重要角色,尤其是受到脂多糖(LPS)等刺激后导致体内炎症介质的产生,机体启动抵御机制从而抑制炎症的继续发生[25]。NF-κB是参与多种炎症性疾病免疫反应介质和关键调节因子表达的转录因子,在产生促炎因子包括NO、前列腺素E2(PEG2)、白细胞介素(IL)-6、TNF-α、诱导型一氧化氮合酶(INOS)和环氧合酶-2(COX-2)中起关键作用[26]。因此,针对性抑制NF-κB的活化对于开发有效的炎症治疗方法十分重要。

本研究采用不同剂量的6种人参属药材提取物处理RAW264.7细胞,发现在0.02、0.20 mg/mL时,均对细胞活力无明显抑制作用。单核巨噬细胞在LPS刺激下,在炎症反应中产生过量的炎症介质,如NO和TNF-α。过度的炎症使身体过度暴露于炎症介质,导致细胞坏死、组织损伤和变性,从而加重炎症[27]。6种人参属药材提取物对LPS诱导RAW264.7细胞NO的释放均有抑制作用,其中屏边三七>人参>珠子参>西洋参>竹节参>三七。采用ELISA法检测LPS和6种人参属药材提取物共同处理24 h后RAW264.7细胞中TNF-α分泌,发现6种人参属药材提取物与LPS组相比均可显著降低RAW264.7细胞分泌的TNF-α含量。NF-κB是炎症反应中的关键转录因子,外界LPS刺激后,IκB产生磷酸化反应并降解,导致NF-κB、IκB发生解离并转移至核内,参与调节细胞因子、趋化因子表达及炎症反应[28]。采用Western blot法对此通路相关蛋白的表达进行分析,发现屏边三七组和竹节参组能显著下调p-NF-κB、IκBα蛋白表达,表明屏边三七和竹节参可通过抑制p-NF-κB、IκBα蛋白,从而减少NF-κB核转位。同时,本研究采用二甲苯所致小鼠耳肿胀炎症模型评价6种人参属药材提取物的体内抗炎活性,结果表明6种人参属药材提取物对小鼠耳肿胀具有剂量依赖性抑制作用,明显减少耳组织真皮结缔组织水肿及炎性细胞浸润,其中屏边三七抗炎效果最好。这一结果可能是由于人参属药材中的共有成分人参皂苷直接抑制皮肤组织中活化的巨噬细胞[29]。

4 结 论

6种人参属药材提取物不同程度地减少炎性介质NO的释放,抑制促炎因子TNF-α的释放,抑制p-NF-κB、IκBα蛋白的表达,减少NF-κB的活化,从而达到抗炎效果。