罗惠芳，王翰庭，王 婵

（武汉商学院食品科技学院，湖北 武汉 430000）

我国为淡水鱼养殖大国，截至2020 年我国鱼类产量占全国淡水养殖产量的83.73%[1]，鳙鱼为我国的四大家鱼之一，受传统烹制方法的影响，基本将鱼骨直接丢弃。鱼骨主要组成元素有蛋白质、灰分、水分及脂肪，将其加工利用，很容易被人体消化吸收。大部分的鱼骨占鱼体质量的10%~15%，含有丰富的蛋白质，若直接丢弃将是极大的浪费。

由于天然蛋白质结构中不同区域的原子随机运动，使其柔性程度不同，刚性结构的蛋白质就难以被人体利用[2]，因此国内外都开始了对食品蛋白质柔性化加工技术的研究。生物酶解法是一种安全和相对温和的方法，已被广泛应用于食物原料加工中，如施永清等人[3]采用双酶解法制备鱼鳞抗菌肽，Yang Ji 等人通过酶解制备了罗非鱼皮明胶水解液等。但鳙鱼骨结构坚硬，若直接酶解效率较低，有研究者发现适度的热处理可以使高级蛋白质结构降解，从而更柔性化，Sang-gi Min 等人研究发现，水热处理可辅助猪皮副产物蛋白质水解物的生产；陈林等人[4]研究得出，水热预处理改变了花生蛋白空间构象、提高了蛋白酶解敏感性，因此有必要通过适当热处理辅助鳙鱼骨蛋白酶解。

通过Alcalase 酶解鳙鱼骨蛋白，以蛋白质回收率、TCA-NSI、水解度为考查指标，分析研究不同热处理时间、热处理温度及底物质量分数对鳙鱼骨蛋白酶解特性的影响。旨在为日后满足市场需求，发掘新的途径进一步开发利用废弃蛋白资源、制造功能性食品等提供理论依据，以提高水产品生产的附加值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

鲜活鳙鱼骨，购自沌阳集贸市场；Alcalase（200 U/mg），源叶生物提供；BCA 试剂盒，Biosharp生物科技公司提供。

1.2 试验试剂

硫酸、氢氧化钠、盐酸、乙醇、甲醛、硼酸、三氯乙酸、石油醚（60~90 ℃）、硫酸铜、硫酸钾、磷酸，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司提供。

1.3 仪器与设备

GZX-9140MBE 型电热鼓风干燥箱，上海博讯生物仪器有限公司产品；HYP-304 型消化炉、KDN-102C 型定氮仪、SZC-101 型脂肪测定仪，上海纤检仪器有限公司产品；HH-4 型数显恒温水浴锅，国华电器有限公司产品；UPT-1-5T 型超纯水机，四川优普超纯科技有限公司产品；YP-30002 型电子天平，上海越平仪器有限公司产品；TDZ4-WS 型台式低速离心机，湖南湘仪仪器开发有限公司产品；YY0027-90 型电热恒温培养箱，武汉精华科仪器有限公司产品；PHS-3C 型pH 计，上海今迈仪器公司产品；KSW型高温炉，武汉精达仪表厂产品；LDZX- 75KBS 型立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂产品；722 型可见分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司产品；YB-1500A 型多功能粉碎机，永康速峰工贸有限公司产品。

1.4 试验方法

1.4.1 鳙鱼骨的制备

将新鲜活鳙鱼进行宰杀、去鳞、去肉，将鳙鱼剔出的大致鱼骨进行沸水隔水蒸煮2.5 min，取出，得到无杂质的鱼骨。鱼骨清洗于37 ℃下烘干，用0.1 mol/L 的NaOH 溶液没过鳙鱼骨浸泡12 h，去除杂蛋白、脂肪等，清洗后再用1%的盐酸没过鱼骨浸泡2 h 脱钙，流水冲洗3 h，于37 ℃下烘干10 h，最后粉碎即可得到鳙鱼骨粉（密封、冷藏保存）。

1.4.2 鳙鱼骨基本成分的测定

根据凯氏定氮法[8]测定鳙鱼骨中的蛋白质，索氏抽提法[9]测其脂肪，根据国标[10]测定其灰分，根据国标中的直接干燥法[11]测其水分。

1.4.3 热处理对鳙鱼骨蛋白的影响

（1） 热处理时间的影响。配置1%的鳙鱼骨溶液置于121 ℃条件下经过5 个不同的加热时间（0，20，45，70，95 min） 后测定蛋白质回收率、水解度。

（2） 热处理温度的影响。配置1%的鳙鱼骨溶液，固定加热时间为30 min，将鳙鱼骨溶液分别置于5 个不同温度（0，60，80，100，121 ℃） 下进行热处理后测定蛋白质回收率、水解度。

1.4.4 酶解单因素试验及酶解工艺

（1） 热处理时间的影响。配置质量分数为1%的鳙鱼骨溶液，分别于100 ℃条件下加热0，20，45，70，95 min，冷却后酶解。

（2） 热处理温度的影响。配置质量分数为1%的鳙鱼骨溶液，固定加热时间为30 min，分别于0，60，80，100，121 ℃下进行热处理，冷却后酶解。

（3） 底物质量分数的影响。分别配置鳙鱼骨溶液质量分数为1%，2%，3%，4%，5%，于121 ℃条件下加热20 min，冷却后酶解。

（4） 酶解工艺流程。对热处理后的鳙鱼骨蛋白溶液加入碱性蛋白酶进行酶解，主要操作工艺为鳙鱼骨溶液经过热处理后冷却至50 ℃左右，加酶量为1.5%（即3 U/mL），通过pH 值8.0 的缓冲溶液将鳙鱼骨溶液调配为pH 值8.0 后，于温度为55 ℃的恒温培养箱中进行120 min 的酶解。反应结束后进行沸水浴灭酶10 min，再以转速4 000 r/min 离心15 min，其上清液即为鳙鱼骨蛋白的酶解产物。

1.4.5 水解度测定

鳙鱼骨水解液中的氨基态氮含量的测定参照国标[9]甲醛滴定法进行测定，原料中的含氮量采用凯氏定氮法测定。水解度的计算公式[10]：

1.4.6 蛋白质回收率测定

采用考马斯亮蓝法得出上清液中蛋白质含量，凯氏定氮法测定原料中总蛋白含量。蛋白质回收率计算公式[14]：

1.4.7 TCA 可溶性氮得率测定

通过BCA 试剂盒测定其离心后的上清液中可溶性蛋白质，原料中的总蛋白质量采用凯氏定氮法测定。TCA 可溶性氮得率计算公式[15]：

1.4.8 数据处理

每个样品均至少3 次平行测定，通过Excel 2016对数据进行计算整理，结果用Mean±SD 表示，利用Origin 2021 软件进行数据分析及图表的绘制。

2 结果与分析

2.1 基本成分的分析

鳙鱼骨粉基本成分见表1。

表1 鳙鱼骨粉基本成分/g·（100 g）-1

由表1 可知，4 种基本成分含量均>10%，尤其是灰分和蛋白质含量更高，此结果表明鳙鱼骨的营养成分很高。鱼肉中的蛋白质含量为15%左右，鳙鱼骨中蛋白质含量为25.93%，鱼骨中的蛋白质因为结构复杂很难被人体消化吸收，但是经过处理的鱼骨蛋白会比植物蛋白更适宜人体所需，因此寻找有效技术充分利用废弃的鳙鱼骨蛋白尤为必要。

2.2 热处理对鳙鱼骨蛋白蛋白质回收率和水解度的影响

热处理对鳙鱼骨蛋白蛋白质回收率和水解度（DH） 的影响见图1。

图1 热处理对鳙鱼骨蛋白蛋白质回收率和水解度（DH） 的影响

由图1 可知，热处理对鳙鱼骨蛋白水解度和蛋白质回收率均产生了一定的影响。由图1（a） 可知，未经过热处理组的蛋白质回收率和水解度分别为2.98%和0.05%，DH 和蛋白质回收率随着热处理温度的上升而持续提升，当热处理温度为121 ℃经过30 min 加热后鳙鱼骨蛋白溶液的DH 和蛋白质回收率分别是未处理组的15.4 倍和103 倍。由图1（b）可知，在121 ℃下经过20 min 加热后其蛋白质回收率和水解度都显著增大，上升速度最快，后缓缓上升，到70 min 后显著下降。可能的原因是高温破坏了蛋白质的高级结构进一步降解为小分子物质，蛋白质肽键不断裂解为短肽链，同时部分蛋白质分子的展开推动了鳙鱼骨明胶的溶出与水解，使得回收率和水解度提高。而当热处理时间过长导致鳙鱼骨蛋白中的一些小分子物质、短肽链（如可溶性蛋白）的损失，而使得回收率降低。在此基础上，通过单因素试验进一步优化不同热处理方式对鳙鱼骨蛋白酶解特性的影响。

2.3 热处理对鳙鱼骨蛋白酶解特性的影响

2.3.1 不同热处理温度对鳙鱼骨蛋白酶解特性的影响

（1） 不同热处理温度对鳙鱼骨蛋白蛋白质回收率和水解度的影响。

热处理温度对鳙鱼骨蛋白酶解特性的影响见图2。

图2 热处理温度对鳙鱼骨蛋白酶解特性的影响

由图2 可知，经过热处理的鳙鱼骨酶解液的蛋白质回收率和DH 随着温度的升高而持续呈上升趋势。这可能是由于经过热处理特别是经过高温的鳙鱼骨蛋白结构舒展，高级结构被降解，更多的酶切位点暴露，使得碱性蛋白酶与鳙鱼骨蛋白充分接触，进一步促进了蛋白酶的水解作用。由图2 可知，当温度上升到121 ℃时的蛋白质回收率和水解度比未经热处理组提高了约40%和5%，相比于其他热处理温度的水解效果最好，由此选取121 ℃为最佳的处理温度较适宜，能够达到在有限条件下充分利用资源的目的。

（2） 不同热处理温度对鳙鱼骨蛋白TCA-NSI 的影响。

三氯乙酸可沉淀十肽以上的蛋白质，TCA 可溶性氮得率即得到酶解液的短肽得率。

热处理温度对鳙鱼骨蛋白TCA-NSI 的影响见图3。

图3 热处理温度对鳙鱼骨蛋白TCA-NSI 的影响

由图3 可知，TCA 可溶性氮得率与热处理温度呈正相关，TCA-NSI 随着温度的升高而提高且在121 ℃下经过30 min 热处理后极速上升，此时鳙鱼骨酶解液TCA-NSI 高达30%是比经热处理组提高了约26%。可能由于经过高温使得蛋白质多肽链分裂为小分子肽键，可见高温处理对鳙鱼骨酶解液的TCA 可溶性氮得率影响很大，与蛋白质回收率的趋势大致相同，均在121 ℃时为最佳热处理温度。

2.3.2 不同热处理时间对鳙鱼骨蛋白酶解特性的影响

（1） 不同热处理时间对鳙鱼骨蛋白蛋白质回收率和DH 的影响。

热处理时间对鳙鱼骨蛋白酶解特性的影响见图4。

图4 热处理时间对鳙鱼骨蛋白酶解特性的影响

由图4 可知，经过热处理的鳙鱼骨酶解液的蛋白质回收率和DH 均明显高于未处理组，其中经过20 min 提升的速度最快，其蛋白质回收率达到44%比未处理组多31%；水解度达到6.5%，是未处理组的4 倍。20 min 后，随着加热时间的增加，水解度增长很缓慢，而蛋白质回收率与时间不成正比，不会随着时间的增加而上升甚至出现下降的现象。这可能是因为加热过度导致蛋白质分子重新组合成致密的网状结构，使得酶切位点被包围，碱性蛋白酶难以对鳙鱼骨蛋白作用，使得水解效果降低。因此最佳的热处理时间应选择20 min。

（2） 不同热处理时间对鳙鱼骨蛋白TCA 可溶性氮得率的影响。

热处理时间对鳙鱼骨蛋白TCA-NSI 的影响见图5。

图5 热处理时间对鳙鱼骨蛋白TCA-NSI 的影响

由图5 可知，经过热处理的鳙鱼骨酶解液的蛋白质回收率和DH 均明显高于未处理组，其中经过20 min 时的TCA-NSI 达到22.4%是未处理组的4.5 倍。而当时间超过20 min 后缓慢上升，45 min 后呈现下降趋势，说明热处理时间过度会导致酶解效果不理想。可能是因为蛋白分子结构重新组合成难分解的状态或小分子物质经过长时间的热处理受到一定的损伤。因此，20 min 可为最佳的热处理时间。

2.3.3 不同底物质量分数对鳙鱼骨蛋白酶解特性的影响

（1） 不同底物质量分数对鳙鱼骨蛋白蛋白质回收率和DH 的影响。

不同底物质量分数对鳙鱼骨蛋白酶解特性的影响见图6。

图6 不同底物质量分数对鳙鱼骨蛋白酶解特性的影响

由图6 可知，在经过同样热处理条件下（121 ℃，20 min） 不同底物质量分数的鳙鱼骨蛋白酶解液的蛋白质回收率和DH 差别很大。在底物质量分数低于3%时，DH 呈缓慢上升趋势，而后则呈显著下降趋势；底物质量分数为2%时，蛋白质回收率便开始显著下降。蛋白质回收率和DH 均没有随着底物质量分数的增加而提高，反而出现下降的现象，原因可能是底物质量分数太高，溶液体系偏于浓稠，水自由度降低，导致鳙鱼骨蛋白经过热处理也难以析出；与此同时，碱性蛋白酶与鳙鱼骨蛋白的酶解位点也变少等原因，使得蛋白质回收率和DH 均有所下降。结合水解度和蛋白质回收率应选择底物质量分数2%为佳，其蛋白质回收率达到44.7%，水解度为7.2%。

（2） 不同底物质量分数对鳙鱼骨蛋白TCA 可溶性氮得率的影响。

不同底物质量分数对鳙鱼骨蛋白TCA-NSI 的影响见图7。

图7 不同底物质量分数对鳙鱼骨蛋白TCA-NSI 的影响

由图7 可知，经过相同热处理条件下（121 ℃，20 min） 在底物质量分数为2%时，TCA-NSI 达到最大为23.7%；当底物质量分数大于2%后，TCA 可溶性氮得率呈现大幅下降趋势，这与蛋白质回收率的趋势大致相同。造成TCA 可溶性氮得率下降的原因可能是由于此指标表征测的是短肽得率，而当底物质量分数过大会导致蛋白难以溶出，酶与鳙鱼骨蛋白的作用点也变小，因此很难将蛋白高级结构降解为短肽。结合成本问题和现实操作等因素，故可选择底物质量分数为2%。

3 结论

试验首先对鳙鱼骨中的基本成分进行了测定，得到其蛋白质含量为25.93%，粗脂肪含量为19.75%，总灰分含量为37.56%，水分为15.54%，说明鳙鱼骨中的营养成分很高，其中蛋白质比鱼肉中蛋白质含量还要高，因此对鳙鱼骨蛋白进行研究对其合理利用尤为必要。以热处理时间、热处理温度为变量；以蛋白质回收率、水解度为指标，分析得出，热处理对鳙鱼骨蛋白产生一定的影响。试验得出经过热处理条件为加热时间121 ℃，加热时间20 min，此时的鳙鱼骨蛋白的蛋白质回收率和水解度分别是未经热处理组的15.4 倍和103 倍。鳙鱼骨粉若不经预处理基本无法溶于水，致密的结构导致蛋白无法溶出，只有借助外力条件才能使其结构降解。

基于热处理会对鳙鱼骨蛋白产生影响的基础上，进一步进行单因素试验研究不同热处理条件对鳙鱼骨蛋白酶解特性的影响。试验结果表明，当加热时间为20 min，加热温度为121 ℃，底物质量分数为2%时，其蛋白质回收率达到44.7%，水解度为7.2%，TCA 可溶性氮得率高达23.7%，分别是未处理组的3.0 倍，4.2 倍，4.7 倍。高温热处理是一种普遍的原料预处理方式，生物酶解是较为安全、可控性强、效率高的水解食品蛋白的方法，两者结合运作高效简单，将鳙鱼骨变废为宝，加工鱼丢弃的下脚料被重新利用，减少资源浪费绿色环保，提供了一条新途径开发利用水产品蛋白资源，使合理利用资源具有美好广阔前景。