刘文斌,李艳兵,周焱涛

骨肉瘤是好发于儿童及青少年的骨组织恶性肿瘤,易复发和转移,预后较差[1]。目前,骨肉瘤发病机制尚未明确。研究[2]显示,骨肉瘤的发生发展与癌基因的异常激活及抑癌基因的失活有关,探究骨肉瘤中异常表达的基因分子,可为其治疗提供分子靶点。长链非编码RNA(lncRNA)和微小RNA(miRNA)是两类小分子非编码RNA,且lncRNA可靶向miRNA进而调控miRNA靶基因的表达,参与肿瘤细胞增殖和凋亡等生命活动,为肿瘤的治疗提供了分子靶点[3-4]。人类白细胞抗原复合体18(human leukocyte antigen complex 18,HCG18)属于一种lncRNA,其在胃癌[5]、肝癌[6]、鼻咽癌[7]和肺腺癌[8]等肿瘤中表达升高,促进这些肿瘤的发展进程。Starbase靶基因软件预测显示,HCG18可能靶向结合miR-34b-5p,而叉头框蛋白p1(forkhead box protein p1,FOXP1)可能是miR-34b-5p的靶基因。miR-34b低表达与骨肉瘤进展过程中的生理病理学活动密切相关,通过上调miR-34b可增强体外骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力,延缓肿瘤进展[9]。FOXP1是叉头框家族成员之一,参与心肌细胞发育、免疫B细胞分化等过程。有报道[10]称,FOXP1在骨肉瘤组织中表达升高,促进骨肉瘤增殖和转移。本研究检测了骨肉瘤组织中HCG18的表达,然后以骨肉瘤U2OS细胞为研究对象,miR-34b-5p/FOXP1轴为切入点,探讨HCG18对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制。现作报道。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2017年5月至2019年10月在我院确诊并行手术治疗的骨肉瘤病人47例瘤组织及对应的瘤旁组织,液氮保存。其中女19例,男28例;年龄4～25岁,平均(14.29±4.51)岁。排除标准:合并其他恶性肿瘤;合并心、肝、肾等重要脏器功能障碍。组织样本取材经病人或家属同意,研究经本院伦理委员会批准。

1.2 细胞和试剂 U2OS细胞株(中国科学院上海细胞库);RNA抽提试剂盒、逆转录试剂盒和PCR试剂盒(大连宝生物);RPMI 1640培养基、双荧光素酶活性检测试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒(北京索莱宝);胎牛血清(FBS)(浙江天杭生物科技股份有限公司);LipofectamineTM2000试剂盒(美国Invitrogen公司);PCR引物、HCG18小干扰RNA(si-HCG18)、乱序无意义阴性序列(si-NC)、miR-34b-5p抑制剂(anti-miR-34b-5p)及抑制剂阴性序列(anti-miR-NC)、HCG18和FOXP1的野生型质粒(WT-HCG18、WT-FOXP1)及突变型质粒(MUT-HCG18、MUT-FOXP1)、miR-34b-5p 模拟物(mimcs)、模拟对照序列(miR-NC)、FOXP1过表达载体(pcDNA-FOXP1)、空载体(pcDNA)(上海生工);兔抗人FOXP1和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)。

1.3 方法

1.3.1 RT-qPCR法检测HCG18和miR-34b-5p表达 将收集的新鲜组织样本在液氮保护下进行研磨,用RNA抽提试剂提取组织总RNA。然后将RNA逆转录生成cDNA,并行PCR扩增。扩增程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共35个循环。引物序列:HCG18上游5′-GAC CGA GAC CAA TGG CAC AG-3′,下游5′-CGA CTA GAT CCG AGA GGA CAC-3′;miR-34b-5p上游5′-ACG ATA GAC CAA CGG CTG AC-3′,下游5′-CGT GTG CGA GGC GAG CGT AGC-3′;GAPDH上游5′-CGA TAG TCG CGA GCT CGG-3′,下游5′-CGA TAG AGG AAA CCA CG-3′;U6上游5′-CGT GTC GTG AGC GAG CAC-3′,下游5′-CGA GCG CTA GAT TCA GAG G-3′。2-△△Ct法计算HCG18相对于内参GAPDH、miR-34b-5p相对于内参U6的表达水平。

1.3.2 U2OS细胞培养和转染 将U2OS细胞在超净工作台中复苏,加含10 % FBS的RPMI 1640培养基,于37 ℃、CO2体积分数5%、湿度97%的培养箱中培养。取对数期U2OS接种于6孔板中(1.0×105个/孔),用LipofectamineTM2000脂质体法,分别转染si-NC(si-NC组)、si-HCG18(si-HCG18组)、miR-NC(miR-NC组)、miR-34b-5p mimics(miR-34b-5p组)、共转染si-HCG18与anti-miR-NC(si-HCG18+anti-miR-NC组)、si-HCG18与anti-miR-34b-5p(si-HCG18+anti-miR-34b-5p组)、miR-34b-5p mimics与pcDNA(miR-34b-5p+pcDNA组)、miR-34b-5p mimics与pcDNA-FOXP1(miR-34b-5p+pcDNA-FOXP1组)。转染12 h后,更换为含10% FBS的RPMI 1640培养基,再培养24 h,RT-qPCR法检测细胞中HCG18或miR-34b-5p表达验证转染效果,方法同1.3.1,并收集细胞备用。同时设置对照组(Control组),细胞用常规培养基培养,不进行任何转染操作。

1.3.3 CCK-8法检测细胞增殖 将各组细胞接种于96孔板中(2.5×104个/孔),培养24 h后,加10 μL CCK-8试剂。孵育2 h,用酶标仪(λ=450 nm)测吸光度值。

1.3.4 克隆形成实验 将各组细胞接种于6孔板中(1.0×104个/孔),每2 d换一次培养基。培养14 d后,弃培养基。用多聚甲醛固定、结晶紫染色后,显微镜观察,对超过50个细胞的克隆记数。

1.3.5 划痕实验检测细胞迁移 将各组细胞接种于6孔板中(1.0×105个/孔),培养4 h后,弃培养基。用200 μL移液器枪头在培养板底部平行于中轴线划两条平行线,并用PBS清洗掉划痕间细胞,测量划痕间距d,记为d0h。更换为新鲜培养基,培养24 h后,再次测量细胞间间距d,记为d24h。划痕愈合率(%)=(d0h-d24h)/d0h×100%。

1.3.6 Transwell法检测细胞侵袭 将Transwell小室置于24孔板中,铺Matrigel基质胶,自然晾干。在上室中加含1.0×104个细胞的细胞悬液,下室加500 μL培养基。培养24 h后,随后弃培养基,用多聚甲醛固定、结晶紫染色。将基质胶下层置于倒置显微镜下观察。随机取5个视野,对视野下的细胞记数。

1.3.7 免疫印迹法检测FOXP1蛋白表达 将各组细胞接种于6孔板中(1.0×105个/孔),培养24 h后,用RIPA试剂提取细胞中总蛋白,并用BCA定量。将定量后的蛋白溶液行12% SDS-PAGE电泳,然后转至PVDF膜,并用5%脱脂奶粉封闭1 h。先分别用FOXP1(1∶500)和GAPDH(1∶1 000)一抗孵育液在4 ℃冰箱中将封闭后的蛋白条带孵育过夜,洗膜后,再用山羊抗兔二抗(1∶1 000)孵育液在37 ℃摇床中孵育2 h。最后加显影液避光显影,凝胶系统曝光拍照,Image J软件分析FOXP1相对于GAPDH的表达量。

1.3.8 双荧光素酶报告基因实验 Starbase靶基因预测软件显示,HCG18与miR-34b-5p、FOXP1与miR-34b-5p的核苷酸序列分别存在连续结合位点(见图1)。将U2OS细胞接种于6孔板中(1.0×105个/孔),用LipofectamineTM2000脂质体法,分别共转染miR-34b-5p mimics与WT-HCG18、miR-NC与WT-HCG18、miR-34b-5p mimics与MUT-HCG18、miR-NC与MUT-HCG18、miR-34b-5p mimics与WT-FOXP1、miR-NC与WT-FOXP1、miR-34b-5p mimics与MUT-FOXP1、miR-NC与MUT-FOXP1,转染时间为12 h。然后换为含10% FBS的RPMI 1640培养基再培养24 h,收集细胞并裂解,经离心(3 500 r/min、5 min)后,取上清液,检测荧光素酶活性,结果以萤火虫荧光强度与海肾荧光强度的比值表示。

1.4 统计学方法 采用t检验、方差分析、q检验及相关分析。

2 结果

2.1 骨肉瘤组织中HCG18和miR-34b-5p的表达及相关性 骨肉瘤组织中HCG18表达量高于瘤旁组织(P<0.01),而miR-34b-5p表达量低于瘤旁组织(P<0.01)(见表1)。Pearson相关性分析结果显示,骨肉瘤组织中HCG18与miR-34b-5p的表达呈负相关关系(r=-0.812,P<0.05)。

表1 骨肉瘤组织中HCG18与miR-34b-5p的表达

2.2 下调HCG18对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响 转染si-HCG18的U2OS细胞中HCG18表达量明显低于Control组和si-NC组(P<0.05),而Control组和si-NC组HCG18表达量差异无统计学意义(P>0.05),表明下调HCG18的U2OS细胞构建成功;与Control组或si-NC组比较,si-HCG18组U2OS细胞吸光度值和克隆形成数降低(P<0.05),划痕愈合率和细胞侵袭数降低(P<0.05),而Control组和si-NC组各检测指标比较差异无统计学意义(P>0.05)(见表2)。

表2 下调HCG18对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响

2.3 HCG18靶向负调控miR-34b-5p 共转染miR-34b-5p mimics与WT-HCG18的U2OS细胞荧光素酶活性显著低于共转染miR-NC与WT-HCG18的U2OS细胞(P<0.01),而共转染miR-34b-5p mimics与MUT-HCG18的U2OS细胞荧光素酶活性与共转染miR-NC与MUT-HCG18的U2OS细胞比较差异无统计学意义(P>0.05)(见表3)。与Control组或si-NC组比较,si-HCG18组U2OS细胞中HCG18表达量降低(P<0.05),而miR-34b-5p表达量升高(P<0.05)(见表4)。

表3 荧光素酶活性检测结果

表4 下调HCG18对骨肉瘤细胞中miR-34b-5p表达的影响

2.4 HCG18靶向miR-34b-5p影响骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭 与si-HCG18组和si-HCG18+anti-miR-NC组比较,si-HCG18+anti-miR-34b-5p组U2OS细胞中miR-34b-5p表达量降低,U2OS细胞吸光度值和克隆形成数升高(P<0.05),划痕愈合率和细胞侵袭数升高(P<0.05),而si-HCG18组与si-HCG18+anti-miR-NC组各检测指标比较差异均无统计学意义(P>0.05)(见表5和图2)。

表5 HCG18靶向miR-34b-5p影响骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭

2.5 miR-34b-5p靶向负调控FOXP1 双荧光素酶活性检测结果显示,共转染miR-34b-5p mimics与WT-FOXP1的U2OS细胞荧光素酶活性显著低于共转染miR-NC与WT-FOXP1的U2OS细胞(P<0.01),而共转染miR-34b-5p mimics与MUT-FOXP1的U2OS细胞荧光素酶活性与共转染miR-NC与MUT-FOXP1的U2OS细胞比较差异无统计学意义(P>0.05)(见表6)。同时,与Control组或miR-NC组比较,miR-34b-5p组U2OS细胞中miR-34b-5p表达量升高(P<0.05),而FOXP1蛋白表达量降低(P<0.05)(见表7和图3)。

表6 荧光素酶活性检测结果

表7 上调miR-34b-5p对骨肉瘤细胞中FOXP1蛋白表达的影响

2.6 miR-34b-5p靶向FOXP1影响骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭 与miR-NC组比较,miR-34b-5p组U2OS细胞吸光度值和克隆形成数降低(P<0.05),划痕愈合率和细胞侵袭数降低(P<0.05);而与miR-34b-5p+pcDNA组比较,miR-34b-5p+pcDNA-FOXP1组U2OS细胞吸光度值和克隆形成数升高(P<0.05),划痕愈合率和细胞侵袭数升高(P<0.05),miR-34b-5p组与miR-34b-5p+pcDNA组各检测指标比较差异无统计学意义(P>0.05)(见表8和图4)。

表8 miR-34b-5p靶向FOXP1影响骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭

3 讨论

骨肉瘤是一种间质细胞来源的恶性肿瘤,其侵袭性强,易复发和转移[11]。骨肉瘤细胞的异常增殖及迁移和侵袭是其发生发展的主要原因[12],抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭可起到治疗骨肉瘤的作用。近年来,随着分子生物学的快速发展,发掘影响骨肉瘤发生发展的基因分子对骨肉瘤的诊断和治疗具有重要意义。lncRNA在真核生物中广泛存在,其可发挥miRNA分子海绵作用,调控miRNA靶基因的表达,进而影响细胞生命活动。KCNQ1OT1[13]、ROR1-AS1[14]和CCAT1[15]等多种lncRNA在骨肉瘤中表达升高,促进骨肉瘤细胞的恶性表型,可能是骨肉瘤治疗的潜在分子靶点。

作为一种lncRNA,HCG18在多种肿瘤中表达增加,对肿瘤发展起促进作用。例如,胃癌中HCG18表达上调,其可通过靶向抑制miR-141-3p的表达间接调控Hippo信号转导,促进胃癌细胞的增殖活性、迁移和侵袭,进而促进胃癌发展[16];HCG18在结直肠癌组织和细胞系中表达上调,其可通过靶向 miR-1271/MTDH轴和Wnt/β-catenin信号通路促进结直肠癌细胞生长和侵袭[17];下调HCG18可通过靶向上调miR-34a降低口腔鳞癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力,HCG18可作为口腔鳞癌治疗的分子靶点[18]。本研究结果显示,骨肉瘤组织中HCG18的表达明显高于瘤旁组织,而下调HCG18阻碍了骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力,提示HCG18在骨肉瘤发生发展中起促进作用,其可能是骨肉瘤治疗的分子靶点。

为了进一步探讨HCG18促进骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制,本研究证实了HCG18可靶向结合并负调控miR-34b-5p,骨肉瘤组织中HCG18与miR-34b-5p呈负相关关系。miR-34b-5p在结肠癌[19]、胰腺导管腺癌[20]、乳腺癌[21]和膀胱癌[22]等肿瘤中均表达降低,通过上调miR-34b-5p的表达可抑制肿瘤细胞的恶性表型,进而抑制肿瘤发展进程。本研究结果显示,miR-34b-5p在骨肉瘤中表达减低,而上调miR-34b-5p降低了骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭性,说明miR-34b-5p对骨肉瘤发展起抑制作用。本研究还显示,下调miR-34b-5p逆转了下调HCG18对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用,进一步提示HCG18通过靶向抑制miR-34b-5p来促进骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭。

此外,本研究证实了FOXP1是miR-34b-5p的靶基因。FOXP1基因位于染色体3p14.1,是一种转录因子,其蛋白产物在不同肿瘤中发挥不同的生物学作用。FOXP1在食管癌[23]、卵巢癌[24]和肺癌[25]等肿瘤中表达升高,发挥促癌基因作用;而FOXP1在结肠癌[26]和膀胱癌[27]等肿瘤中表达降低,作为抑癌基因起作用。本研究显示,下调HCG18降低骨肉瘤细胞中FOXP1蛋白表达,而上调FOXP1逆转上调miR-34b-5p对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响,进而提示HCG18通过竞争性结合miR-34b-5p进而上调FOXP1的表达来促进骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭。

综上,HCG18在骨肉瘤组织中表达升高,其可靶向miR-34b-5p/FOXP1轴促进体外骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭,其可能是骨肉瘤治疗的分子靶点。但本研究尚需要在体内证实HCG18/miR-34b-5p/FOXP1轴对骨肉瘤发生发展的影响。