杨红红 巴 涛 倪 凡 朱余蓉 常向云

石河子大学医学院第一附属医院内分泌代谢科 （石河子 832000）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一种危害人类健康的代谢性疾病，由IDF统计全球约有4.63亿人次患有糖尿病；而我国2型糖尿病（type 2 diabetes millitus，T2DM）在糖尿病人群中的占比90%以上［1-2］。T2DM长期不仅累及脑、心、眼、肾等多器官的病变，而且还与多种肿瘤的发生、发展密切相关，严重威胁人们的生存及生活质量［3-4］。肝脏是葡萄糖和脂类合成、代谢、储存及再分配的核心器官，是胰岛素作用的主要靶组织，同时肝脏组织还会分泌一系列的肝激素及脂肪因子来参与血糖、血脂的调节［5］。而在T2DM中，由于高糖状态使肝脏组织中糖代谢的中心枢纽6-磷酸葡萄糖下游的代谢途径增加，引起肝脏合成的甘油三酯增加、异位脂质在肝脏中堆积，导致肝脏脂肪变性，加速胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）［6-7］。环状RNA（circRNA）是一种不被核酸外切酶降解的特殊类型的闭环结构的非编码RNA，通过海绵作用吸附miRNA，影响靶基因的表达参与多种疾病的发生发展、发展［8］。尤其是在糖尿病这一领域，已有多项研究［9-10］表明circRNA参与其中。Hsa-circRNA-0003340是位于人体第7号染色体（chr7）：44684925-44687358（ http：//www.circbank.cn/search.html），基因同源性分析显示，该circRNA也存在大鼠体内，位于大鼠第14号染色体chr：86434307|86438230，由OGDH基因反剪产生。肝脏作为胰岛素的主要靶组织，参与血糖调节，circRNA在T2DM肝脏组织中的表达鲜有研究。因此本研究拟通过观察circRNA-0003340在T2DM大鼠模型肝脏组织中的表达情况，探讨circRNA与T2DM的关系，为深入研究circRNA在T2DM的发生发展过程中的调控功能提供理论基础及实验依据，为T2DM的诊治开拓新的研究方向。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂和仪器

无特定病原体（SPF）级雄性SD大鼠30只（n=30），5周龄，体质量约（200±20）g，购于新疆医科大学动物实验中心。链脲佐菌素（Streptozotincin，STZ）购于美国Sigma公司，血糖测试仪购于罗氏公司，ELISA试剂盒购自武汉云克隆科技有限公司。cDNA反转录试剂盒、PCR试剂盒均购于日本TAKARA公司，Trizol试剂购于美国Invitrogen公司，引物购自上海生工。苏木红素、伊红染液均购自武汉塞维尔生物。

1.2 动物模型的建立与分组

将SD大鼠适应性饲养1周，随机分为正常对照（normal control，NC）组10只与造模组20只。造模组高脂高糖饲料饲养4周，于第4周末禁食12 h，按30 mg/kg给予一次性腹腔注射1%STZ，72小时后尾静脉采血测血糖，以空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）≥11.1 mmol/L或随机血糖≥16.7 mmol/L作为T2DM造模成功的标准。2型糖尿病模型建立成功后继续高脂高糖饲料再喂养到8周［11］。8周后随机分为正常对照组与造模组各6只大鼠进行后续研究。

1.3 腹腔糖耐量实试验及胰岛素耐量试验

建模成功后的第4周，对2组SD大鼠隔夜禁食12 h后行腹腔糖耐量（introperitoneal glucose tolerance test，IPGTT）试验，依次腹腔注射20%葡萄糖（2 g/kg），分别于0、15、30、60、90、120 min使用罗氏血糖仪测大鼠尾静脉血糖并记录实验数据。隔日对2组SD大鼠行腹腔胰岛素耐量（introperitoneal insulin tolerance test，IPITT）实验，每组禁食6 h，依次腹腔注射胰岛素注射液（0.75 U/kg），分别于0、15、30、60、90、120 min使用罗氏血糖仪测大鼠尾静脉血糖并记录实验数据。

1.4 各组生化指标的测定

造模成功第6周末，取尾静脉血用罗氏血糖仪测血糖；处死SD大鼠，取颈静脉血3 mL，3 000 r离心取上清液，酶联免疫吸附法（ELISA法）测定SD大鼠的空腹血清胰岛素（fasting insulin，FINS）、糖化血红蛋白（glycated hemoglobin，HbA1c）。全自动生化仪测血清FPG、总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）。计算胰岛素抵抗指数（homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR）=FINS×FPG/22.5。

1.5 HE染色

将胰腺组织标本置于4 ℃的10%的福尔马林溶液中固定，石蜡包埋处理。将石蜡切片依次置入二甲苯、无水乙醇、75%酒精脱蜡，用塞维尔苏木素染液染色3～5 min，自来水冲洗；塞维尔生物苏木素反蓝液进行反蓝，自来水冲洗，置入85%、95%的酒精分别脱水5 min；伊红染色5 min，用无水乙醇、二甲苯进行脱水透明，封片。每张切片随机选取3个高倍镜视野（×100），观察比较2组SD大鼠胰岛细胞的形态。经具有丰富的临床经验的3位病理科医师复审切片，确保真实性及准确性。

1.6 RT-PCR检测大鼠肝脏组织circRNA-0003340的表达

麻醉处死SD大鼠后立即打开腹腔，无菌环境下分离新鲜的肝脏组织，置于无菌袋中冻存于-80 ℃冰箱中备用。按照试剂操作说明书提取总RNA，以总RNA的1.0 μg为逆转录反应模板，进行逆转录，总的反应体积是20 μL，反转录合成cDNA，PCR扩增circRNA-000334片段。circRNA-0003340及内参照GAPDH的引物有上海生工生物工程公司合成设计。PCR的反应体积为20 μL，反应体系为40个循环，先95 ℃预变性30 s，然后95 ℃变性15 s，再把温度降到60 ℃，30 s进行退火/延伸反应。本研究拟使用管家基因GADPH作为内参照。circRNA的相对表达使用经典方法-ΔΔCt法，即2-ΔΔCt，每个样本重复3次，取平均值，2-ΔΔCt越大，代表circRNA的相对表达水平越高。

表1 用于分析circRNA-0003340表达水平的RT-qPCR引物

1.7 统计学方法

采用SPSS 23.0统计软件和Graphpad Prism 8.0进行统计学分析。非正态分布的计量资料以中位数±四分位间距M（P25，P75），正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用Mann-Whitney U检验。Spearman相关分析2组间肝脏组织中circRNA-0003340的表达水平与各指标的相关性。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组生化指标及circRNA-0003340表达水平比较

与NC组比较，T2DM组的AST、ALT、FPG、HAb1c、FINs、HOMA-IR、TG、TC、LDL-C均升高（P＜0.05），HDL、circRNA-0003340的表达水平降低（P＜0.05），见表2、3。

表2 2组血清AST、ALT、FPG、HbA1c、FINs、HOMA-IR水平比较 （n=6）

表3 2组血脂水平比较 （n=6）

2.2 2组IPGTT及ITT结果比较

在0、15、30、60、90、120 min与NC组比较，T 2 D M 组的血糖水平均高于N C 组（P＜0.05），见图1。

图1 2 组IPGTT、ITT 结果比较

2.3 各组大鼠胰腺组织的HE染色

与NC组比较，T2DM组胰岛细胞明显缩小，胰岛细胞之间的间隙增大，并且出现空泡变性。与T2DM比较，NC组胰岛细胞更饱满，数量更多（见图2）。

图2 2 组胰腺HE 染色（100×）

2.4 2组SD大鼠肝脏组织中circRNA-0003340的表达情况变化

circRNA-0003340在T2DM组大鼠肝脏组织中的表达较NC组大鼠肝脏组织中的表达下调，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3。

图3 各组大鼠circRNA-0003340 在肝脏组织中的表达

2.5 SD大鼠肝脏组织中circRNA-0003340与生化指标的相关性分析

Sperman相关分析显示，大鼠肝脏组织中circ-0003340表达水平与FPG、TG、TC呈负相关（r=-0.829、-0.943、0.886，P＜0.05，见表4）。

表4 大鼠肝脏组织circRNA-003340表达水平与各指标的相关性

3 讨 论

circRNA大量存在于真核细胞内，具有高度稳定性、特异性、敏感性的表达特点，参与脂肪肝、胰岛素抵抗、糖尿病及并发症的发生发展［12］。circ-0003340是本课题组前期通过基因测序技术在健康人群与T2DM人群中筛选出的具有明显差异性表达的circRNA，基因同源性分析发现同样存在于大鼠体内。

已有多项研究证实了circRNA参与糖尿病及并发症的发生发展。hsa-circ0054633可能通过调节细胞周期及细胞代谢，影响β细胞的增殖成为诊断T2DM的新生标志物［13］。糖尿病性肾病中circ-010383的下调通过作为miR-135a的海绵促进蛋白尿的形成及肾脏纤维化［14］。circ-RNA072097可能作为miR-3150a3p的海绵，通过调节KRAS在糖尿病足溃疡中发挥作用［15］。糖尿病性视网膜病中circCOL1A2 在VEGF的作用下参与调节视网膜微血管内皮细胞的增殖与凋亡［16］。而此外，Liang等人［17］研究发现his-circRNA-0003340在食道鳞状细胞癌中通过与海绵化mir-615-5p参与谷氨酰胺代谢及糖酵解过程，而肝脏是糖、脂代谢的重要器官，猜想circRNA可能也通过海绵化mir影响血糖水平，参与2型糖尿病的发生发展。Zhang等人［18］研究发现高血糖通过增加细胞内活性氧干扰电子运输系统及糖酵解及ATP的产生，这将影响三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA），而TCA是糖脂代谢的桥梁，间接影响SREBPs（是甾醇调节元件结合蛋白），从而诱导肝脏脂肪变性［19］，增加了非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的患病风险。最新证据显示，T2DM是NAFLD的独立危险因素，IR又是NAFLD重要发病机制，但未有强有力的证据表明糖尿病、IR、NAFLD之间有某种明确关联。同时，circRNA具有一定的组织特异性与时间特异性，据组织特异性（tissue specific，TS）circRNA数据库（http：//gb.whu.edu.cn/TSCD）显示不同的组织circRNA的丰度有明显的特异性，且与发育阶段、物种相关，例如在成年人类中，食道、肝脏中TS circRNA的丰度很高，在胎儿时期，大脑、骨骼肌中TS circRNA的丰度更高，而在小鼠的大脑、睾丸组织中具有最高的TS circRNA丰度［20］。

本研究通过构建T2DM大鼠模型，测定SD大鼠的空腹血糖及分离SD大鼠的胰腺组织行HE染色和免疫荧光双重证实造模的成功性及真实性。HE染色显示T2DM大鼠的胰岛体积较NC组明显缩小，胰岛个数明显减少，在组织学水平再次提示T2DM造模成功。在本研究中T2DM的成模率约为50%，考虑与饲养SD大鼠的环境及大鼠习性相关，尤其是冬季室内温度偏低，大鼠更具有攻击性，彼此之间相互撕咬（大鼠尾巴、爪子），增加感染风险，从而降低了成模率。

本研究中，T2DM组血浆中的TG、TC、LDL-C明显高于NC组，表现出明显的脂代谢紊乱；AST、ALT水平高于NC组，表现出肝功受损；FPG、HAb1c、FINs、HOMA-IR水平均高于NC组，提示胰岛素抵抗，这与韩等人［21］研究结果一致。IPGTT和ITT试验表明T2DM组胰岛素分泌节律异常，从而说明其T2DM组的胰岛功能受损。相关分析显示大鼠肝脏组织中circRNA-000334表达水平与F P G、T G、T C 呈负相关，提示circRNA-0003340可能参与糖脂代谢，促进2型糖尿病的发生发展。与NC组相比，T2DM组中circRNA-0003340在肝脏组织中表达水平下调，而本课题组前期研究发现在SD大鼠T2DM组的外周血中circRNA-0003340表达水平上调，这与本研究结果相悖［11］，查阅相关文献提示其可能与环状RNA的组织特异性或时间特异性相关。在Zhao等［22］研究中发现circRNA SCAR在非酒精性脂肪性肝炎的肝脏组织中的表达水平是下调的。Piwecka等人研究发现ciRS-7/CDR1as在脑组织中表达量最高，而在其他组织表达水平明显低下，且病理状态下会抑制circRNA的表达［23-24］，再次论证了circRNA功能的特殊性。

综上所述，2 型糖尿病大鼠肝脏组织中circRNA-0003340的表达水平是明显下调的，可能通过参与糖脂代谢来影响2型糖尿病的发生发展。