王铁固,朝郁坤,卜文曼,宋奕良,赵元增

（1.河南科技学院生命科技学院,河南新乡453000;2.现代生物育种河南省协同创新中心,河南 新乡453000）

甘薯（Ipomoea batatas L.）是重要的粮食、饲料、工业原料和生物能源作物,为全球第七大粮食作物,也是我国五大粮食作物之一,具有高产、稳产和多用途特点[1],为我国甚至世界粮食安全和能源安全发挥了重要的作用[2-4].甘薯由于产量高、抗逆性强、适应性广和光合效率高等特点,因此自二十世纪六、七十年代始被全球广泛种植.我国是甘薯生产大国之一,种植面积和总产量分别占世界的45%和75%左右[5].如今甘薯已成为我国的第四大粮食作物,仅次于小麦、水稻和玉米,总产量居世界首位[6].但是,由于甘薯是无性繁殖的作物,主要通过块根和茎蔓进行繁殖,因此在栽培时容易受到病毒的侵染而且难以防治[7].甘薯病毒病对甘薯产量和品质有较大影响,特别对甘薯增产存在明显的负面影响[8],严重可导致甘薯品种退化、产量缩减、经济效益下降等诸多问题,其在我国的发病率高达60%～90%[11].据数据统计,甘薯病毒病导致我国每年约损失40 亿元[10].

目前防治甘薯病毒病最有效的方法是通过甘薯茎尖分生组织培养来获取脱毒苗, 由此保障甘薯的稳定高产和品种优化.利用茎尖存在无病毒组织,继而在无菌条件下切取甘薯茎尖无病毒组织进行离体培养,可得到不带病毒的植株[11].在进行甘薯的茎尖分生组织培养时,外植体的消毒方法可以影响到茎尖的污染率和成活率, 目前对甘薯外植体进行消毒处理有体积分数为75%的乙醇溶液、0.1%的升汞以及二者相结合的方法.在甘薯茎尖脱毒培养的过程中6-BA、NAA 等激素起着关键作用.6-BA 为细胞分裂素,其主要作用是促进芽的形成,也可诱导愈伤组织的发生.NAA 为植物生长调节剂,能够促进细胞分裂与扩大,诱导甘薯不定根的形成与发育.在甘薯脱毒苗的组织培养过程中,只有通过添加外源激素,才能打破个体内源激素间的平衡,并且要有适当的浓度配比,才能使甘薯芽的分化和生长达到最佳点.

许多研究结果表明,不同的甘薯品种之间由于基因型的差异,因此采用不同的外植体消毒方法和培养基中不同激素的浓度配比,获得的植株再生率和脱毒率也不同.百薯2 号是河南科技学院甘薯育种团队选育的叶菜型紫薯新品种,具有高产优质、茎叶甘甜可口、营养丰富等特点.2022 年申请了国家植物新品种保护.本研究以百薯2 号为实验材料,采用不同的外植体消毒处理和不同的激素浓度配比,以期获得百薯2 号茎尖组织培养脱毒苗的最佳培养体系,为百薯2 号在生产上的推广应用提供参考.

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为百薯2 号,由河南科技学院甘薯育种团队提供.外植体从试验田的百薯2 号植株中选取生长健壮的1 cm 左右甘薯顶芽,去掉多余叶片.随后在自来水下冲洗8～10 s,并用毛刷洗去表面的灰尘及泥土.

1.2 试验方法

1.2.1 外植体消毒 在超净工作台中将洗净的甘薯顶芽放入烧杯中进行表面消毒, 采取A:体积分数为75%的乙醇溶液8 s+0.1%升汞6～7 min、B:0.1%升汞6～7 min、C:体积分数为75%的乙醇溶液3～5 s+0.1%升汞3～4 min 三种不同的消毒处理方法进行消毒,每种处理消毒10 个茎尖,4 次重复.消毒完成后用无菌水再次涮洗2～3 次,随后将其置于已高温灭菌的操作滤纸表面待用.

1.2.2 茎尖剥离 将消毒好的甘薯顶芽利用解剖镜在超净工作台中先剥去幼叶,到5～6 层时,采用“一刀切”的快速剥离技术,即使用已消毒的解剖刀一刀切下,然后用解剖针分离的快速剥离技术,将解剖镜下较大的叶原基切除,随后用解剖针将茎尖顶端的生长点分离开来.

1.2.3 茎尖接种 使用解剖针将甘薯茎尖顶端的生长点挑到高温灭菌之后并装有培养基的培养瓶中,在此过程中应始终保持于酒精灯上方操作,避免实验发生污染进而影响茎尖培养的脱毒效果.

1.2.4 茎尖诱导 茎尖生长点接种于培养瓶后便开始茎尖诱导.分别采取13 种不同处理的激素浓度配比培养基对其进行培养,具体见表1.每种处理的培养基诱导10 个茎尖,4 次重复,30 d 后调查其茎尖诱导率.

表1 甘薯茎尖脱毒培养基6-BA 与NAA 配比Tab.1 Ratio of 6-BA and NAA in sweet potato stem tip virus-free medium

1.2.5 再生苗的增殖诱导 茎尖培养30 d 左右即可分化出不定芽, 随后开始增殖生根长叶形成再生苗,60 d 后检查其成苗率.

1.2.6 再生苗根的诱导 脱毒再生苗的快速繁殖可以利用单个带叶片茎段进行,即在无菌的条件下把再生苗茎段利用消毒后的剪刀剪切为几部分小茎段,每一部分小茎段分别带一片叶,随后用镊子将其扦插移植入新的MS 培养基中,诱导单茎叶生根以形成一颗完整植株.

1.2.7 培养条件 上述所有使用的培养基均添加蔗糖3%/mL、琼脂0.44%/mL,pH 值为5.8,120 ℃高温灭菌20 min,培养室温度为（25±2）℃,光照时间13 h/d,光照强度2 500 lx.

1.2.8 再生苗的主要病毒检测 脱毒再生苗在培养基中培养50～60 d,叶片数长到5～6 片左右,对其进行主要病毒的检测,检测的病毒种类有:甘薯卷叶病毒（SPLCV）;甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）;甘薯病毒2（SPV2）;甘薯潜隐病毒（SPLV）;甘薯褪绿斑病毒（SPCFV）;甘薯G 病毒（SPVG）;甘薯褪绿矮化病毒（SPCSV）.将脱毒再生苗从培养基中取出,剪下新鲜叶片3～4 片,送至河南华智营养科技有限公司进行病毒检测.

1.2.9 统计分析 污染率、成活率的计算分别见下列公式

数据利用SPSS Statistics Version 19 进行统计分析.

2 结果与分析

2.1 不同的外植体消毒方法对茎尖成活率影响

不同外植体消毒方法处理获得的愈伤组织污染率和成活率列入表2.由表2 可知,外植体的不同消毒方法对愈伤组织的污染率和成活率有显著影响.其中处理A 为最佳,获得的愈伤组织成活率最高,污染率最低.而单一采用0.1%升汞的处理B 效果最差,成活率最低,污染率最高.这一结果与蒋素华等[12]、丁明珠等[13]、刘扬等[14]结果有一定差异,表明不同甘薯品种茎尖组织培养时可采用不同的外植体消毒方法,已获得最佳的处理效果.

表2 不同消毒方法对茎尖成活率的影响Tab.2 Effects of different disinfection methods on survival rate of stem tip

2.2 不同的激素质量浓度培养基对茎尖诱导的影响

将茎尖生长点接种到培养基30 d 后观察其生长状况,统计出芽的茎尖数,计算诱导率,结果见表3.

表3 不同培养基配比对茎尖诱导的影响Tab.3 Effects of different media ratio on stem tip induction

对茎尖诱导率的结果进行差异显著性比较,结果如图1 所示.由图1 可知,不同激素质量浓度配比对茎尖诱导的效果有着显著影响.百薯2 号茎尖在无激素的MS 培养基中没有诱导效果;在添加1.0 mg/L 6-BA+0 mg/L NAA 的培养基A2处理中,百薯2 号茎尖诱导率最高,平均值达到0.98±0.05,其茎尖生长较快,不定芽发育正常,叶芽呈正常绿色;在添加0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA 的A1+B3处理中,茎尖诱导率最低,平均值为0.60±0.08,其茎尖大多仅分化为愈伤组织,不定芽分化较少,只生长出少量叶片.说明不同的6-BA 和NAA 激素浓度配比对百薯2 号茎尖诱导有不同的促进和抑制作用,茎尖诱导培养基的最佳选择为A2.

图1 不同处理方法对茎尖诱导影响的显著性差异Fig.1 Significant difference of different treatment methods on shoot tip induction

2.3 不同的激素质量浓度培养基对再生苗增殖的影响

茎尖培养30～40 d 左右即可分化出苗,40～50 d 后可增殖5～7 片叶.不同处理百薯2 号茎尖的成苗率结果见表4.

表4 不同培养基配比对再生苗增殖的影响Tab.4 Effects of different media ratio on the proliferation of regenerated seedlings

不同的6-BA 和NAA 激素质量浓度配比对百薯2 号再生苗增殖的影响显著性比较结果如图2 所示.由图2 可知,不同质量浓度配比的6-BA 和NAA 对百薯2 号再生苗的成苗率影响达到显著水平.在添加1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA 的培养基A2+B1处理中,百薯2 号再生苗成苗率最高,平均值为0.90±0.08,其再生苗生长发育快,叶片和不定根数量多,叶片呈正常绿色且茎段较粗;在添加0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/LNAA 的A1+B3处理中,再生苗成苗率最低,平均值为0.40±0.08,其大多未形成完整的再生苗或仍为愈伤组织,其原因可能是百薯2 号含内源激素造成的.这一结果与黄迎冬等[15]、杨育峰等[16]、胡琳琳等[17]的研究结果有一定差异,表明不同甘薯品种之间的茎尖分生组织的脱毒培养体系并不一致.

图2 不同处理方法对再生苗增殖影响的显著性差异Fig.2 Significant differences of different treatment methods on the proliferation of regenerated seedlings

2.4 再生苗的主要病毒检测结果

我国已报道的甘薯病毒有20 多种,对甘薯生产影响较大的主要有马铃薯Y 病毒属病毒、甘薯双生病毒和甘薯褪绿矮化病毒等[18].本试验针对主要的8 种病毒:甘薯卷叶病毒（SPLCV）、甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）、甘薯病毒2（SPV2）、甘薯潜隐病毒（SPLV）、甘薯褪绿斑病毒（SPCFV）、甘薯G 病毒（SPVG）和甘薯褪绿矮化病毒（SPCSV）,将获得百薯2 号脱毒再生苗委托河南华智营养科技有限公司进行病毒检测,检测结果如图3 所示.由图可见,本试验获得的百薯2 号茎尖脱毒再生苗均未检测出上述病毒.

图3 百薯2 号样品病毒RT-PCR 扩增产物电泳图Fig.3 Electrophoresis of RT-PCR amplification products of Baishu 2 sample virus

3 结论

本研究以百薯2 号为试验材料,对百薯2 号茎尖脱毒培养技术体系进行了优化.

结果表明,不同的甘薯品种之间采用不同的外植体消毒方法效果存在明显差异.体积分数为75%的乙醇溶液8 s+0.1%升汞6～7 min,对于百薯2 号茎尖外植体组织的消毒效果最好,可有效地降低外植体的污染率,提高成活率.

在甘薯脱毒苗的组织培养过程中,只有通过添加外源激素,才能打破个体内源激素间的平衡,并且要有适当的质量浓度配比,才能使甘薯芽的分化和生长达到最佳点.本试验结果中不同的激素质量浓度配比对百薯2 号茎尖的诱导率和再生苗的增殖有着显著影响.其中MS+1.0 mg/L 6-BA+0 mg/L NAA 为最佳茎尖诱导培养基,平均诱导率为0.98±0.05;MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA 为最佳再生苗增殖培养基,平均成苗率为0.90±0.08.

本研究进一步可对百薯2 号无糖培养快速繁殖脱毒种苗技术进行探索, 以期为百薯2 号在生产上的快速推广应用提供参考.