于佳佳，景加荣，薛 兵，王玉涵，李 飞

（1.上海裕达实业有限公司，上海 200240；2.上海卫星装备研究所，上海 200240）

蒸馏酒的乙醇浓度一般高于发酵产物，属于酒精度数较高的烈性酒，其中酒精和水的含量高于90%[1]，制作过程主要为酿造、蒸馏、冷却。世界六大蒸馏酒包括白酒、朗姆酒、金酒、白兰地、伏特加和威士忌，不同蒸馏酒的生产工艺存在较大差别，例如白酒在发酵过程中淀粉转化为糖和糖转化为酒精同时进行，而其他蒸馏酒（如威士忌和伏特加）淀粉转化为糖和糖转化为酒精接续发生，或者糖转化为酒精单独发生。白酒在生产过程中，蒸馏工艺大多是在固态下进行[2]。威士忌主要有两种类型：麦芽威士忌和谷物威士忌，多数品牌的威士忌是由多种单一麦芽威士忌和谷物威士忌混合而成[3]。白酒主要为谷类物质（高粱、玉米、大米等）或者水果发酵形成，不同原料形成的白酒风味不同[4]，主要包括酱香型酒、兼香型酒、清香型酒等，其中酱香型酒以茅台为代表，口子窖属于兼香型酒。蒸馏酒因发酵工艺会产生丰富的物质成分，这些物质影响蒸馏酒的风味、存储条件等[5]。目前针对这些物质建立了许多前处理方法与分析手段。

常见的分析方法为光谱法，如红外光谱[6-7]、紫外-可见光光谱[8]、荧光光谱[9]等；色谱法，如气相色谱[10]、色谱-质谱联用[11-12]等。为了更加精准分析蒸馏酒中的物质成分，对样品处理方面进行了大量的研究，形成多种前处理方法，如固相微萃取和搅拌吸附萃取[13-14]、液液萃取[15]等。在检测设备方面，多种高性能检测设备用于物质分析，如二重气相色谱-质谱联用设备分析威士忌中的乙酯类物质[16]；傅里叶变换离子回旋共振质谱和液相色谱与质谱串级区分两类不同威士忌之间的主要差异[17]；气相色谱与飞行时间质谱联用分析白酒的风味物质成分[18]等。通过开发新型前处理方法和提升检测设备的性能，目前已获得了大量的蒸馏酒主要物质成分数据信息，截至2017 年已经识别出的白酒物质成分超过1800 种[19]，涵盖有机酸类、酯类、醇类、醛类、酚类、杂环、萜烯和芳香族化合物等[20-23]，但这些物质不可能全部用于鉴别不同种类酒的差异性。另外，已识别的物质成分不可能涵盖酒的全部风味物质。

大量研究主要集中在酒类风味物质的识别上，对简化酒类差异性识别的研究较少，目前主要集中在同型酒的分类或特征物质识别，如方差分析对不同品种红葡萄酒的挥发性化合物的特征提取分析[24]；主成分分析（Principal components analysis，PCA）对多种威士忌进行分类[25]；正交偏最小二乘法区分威士忌的类型（混合威士忌或单麦芽威士忌）[26]；聚类分析确认不同啤酒之间的相似性[27]；偏最小二乘-判断分析不同酒的产地[28]等。针对复杂多样的数据，可以对数据信息进行处理，缩小关注物质的范围。

本研究利用电喷雾离子源-质谱仪直接进样对威士忌和白酒进行风味物质成分测试，获得扫描范围内所有物质信息，利用多元分析方法对结果进行处理，剔除品牌、年份影响的特征物质，缩小特征物质的关注范围。通过主成分分析及其载荷图筛选出具有差异性的物质，利用热图验证筛选结果的可靠性，再通过不饱和性[26]和范式图[29]推算出差异性物质的可能结构，建立一种直接质谱法结合数据分析对蒸馏酒进行差异性物质筛选的方法。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

酒样：威士忌选取TALISKER 威士忌（10 年）：单麦芽酒，英国；GLENKINCHIE 威士忌：单麦芽酒，苏格兰；HIBIKI 威士忌（21 年）：调和酒，日本。白酒选取茅台酒（2010 年、2013 年）：酱香型，中国贵州仁怀市；口子窖（10 年型）：兼香型，中国安徽淮北市。

试剂：甲醇（色谱醇），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；去离子水，自制；校正液与利血平，美国赛默飞世尔公司（Thermo Fisher）。

仪器设备：LTQ Orbitrap XL 质谱仪（配有电喷雾离子源（ESI）及Xcalibur1.2 数据处理系统），美国赛默飞世尔公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 质谱条件

正离子模式，电喷雾（ESI）离子源；传输线温度275 ℃；LTQ 模式；喷雾电压：4.0 kV；管状透镜电压：125 V；样品流速：20 μL/min；质量扫描范围：50～2000 u。

1.2.2 实验步骤

质谱仪使用前，先用利血平进行调谐，用阴阳离子校正液进行校正，保证仪器的结果准确。实验用100 μL 蒸馏酒样品加入1∶1 的甲醇与水溶液中稀释100 倍，取500 μL 样品进行测定，每个样品测试5 次。样品测试前需要进甲醇-水溶液进行清洗，减少实验误差。

1.2.3 数据处理方法

谱图分析采用Xcalibur1.2 数据处理系统（Thermo Fisher），数据统计分析与作图采用simca14.1 和Origin2018，PCA 分析采用simca14.1。范式图利用Xcalibur1.2 进行分析得到相对分子量下的可能化学式，对这些化学式进行数据分析，元素选择C、H、O、N、S，并计算O/C 和H/C，结果用Origin2018 作图。分析时charge 设定为1，质量偏差设置为10 mg/L。

2 结果与分析

2.1 不同蒸馏酒的质谱结果

针对不同蒸馏酒进行质谱测试，并筛选不同蒸馏酒的主要质谱峰，ESI源是软电离方式，得到的结果多为分子离子峰，这对实验建立很有帮助[30]。通过全扫描方式获得了6 种蒸馏酒的质谱图，识别出各种蒸馏酒的主要物质成分。结果发现，单麦芽威士忌、混合威士忌、茅台、口子窖四类蒸馏酒之间主要物质存在明显差异，考虑产地和年份因素，筛选单麦芽威士忌的特征峰3 种，混合威士忌特征峰4种，茅台特征峰2种，口子窖特征峰4种。

具体结果如图1 所示，其中a—c 为威士忌：（a）为TALISKER 威士忌，（b）为GLENKINCHIE 威士忌，（c）为HIBIKI 威士忌；d—f 为白酒：（d）为茅台酒（2010 年），（e）为茅台酒（2013 年），（f）为口子窖。根据原始谱图发现，在m/z 介于50～100 u、500～2000 u 之间无质谱峰出现（信噪比不大于3），因此，图1 中横坐标范围为100～500 u。TALISKER 主要质谱峰在m/z=141[29]、m/z=197[29]、m/z=274[29]、m/z=318 和m/z=365[29]等；GLENKINCHIE 主要质谱峰在m/z=203[29]、m/z=274[29]、m/z=302、m/z=318 和m/z=365[29]等；混合威士忌HIBIKI 主要质谱峰在m/z=233[29]、m/z=261[29]、m/z=277[29]、m/z=321[29]等；2010年茅台酒的主要质谱峰在m/z=136[29]、m/z=141[29]、m/z=196[29]等；2013 年茅台酒的主要质谱峰在m/z=118[29]、m/z=136[29]、m/z=156[29]、m/z=197[29]、m/z=279、m/z=317 等。经过整理发现，单麦芽威士忌酒的主要质谱峰在m/z=274[29]、m/z=318 和m/z=365[29]，与混合威士忌的特征峰区别明显；不同年份茅台酒的主要质谱峰在m/z=136[29]、m/z=196[29]；口子窖在m/z=118[29]、m/z=141[29]、m/z=156[29]、m/z=258等处均存在强质谱峰，茅台酒与口子窖的主要特征峰同样存在明显区别。

图1 威士忌和白酒质谱图

2.2 统计学分析

将威士忌和白酒质谱结果分别做PCA 分析，多数威士忌均能用2 个主成分因素代表，其中单一威士忌由于选取的产地不同而分散，但与混合威士忌有明显的区分。茅台酒因年份不同而分散，但与口子窖区分明显。威士忌比白酒分散，主要原因在于白酒生产厂家相同，而威士忌来自不同国家，呈多元化，上述结论从质谱结果的主要特征峰可以得到佐证。载荷图与PCA 图在布局上的结果具有相关性，图中的点代表质荷比，颜色代表区域内点密度（Density），数值越高，区域内点密度越大，点数越多。载荷图显示了不同质荷比之间的相关性，相关性强的数据相近，相关性相反的数据分布在通过原点的线的两端，p1和p2接近0的点不能分析。通过载荷图可以进一步筛选出各蒸馏酒主要特征峰中关联性较高的特征物质，其中单一威士忌的特征峰2 种（关联性高），混合威士忌的特征峰2 种（关联性高），白酒特征峰两种（关联性高）：茅台的特征峰1种，口子窖的特征峰1种。

具体结果如图2，图2a为威士忌PCA分析结果，黑色（B）代表混合威士忌，白色（M）代表单一威士忌。图2c为白酒PCA分析结果，黑色（K）代表口子窖，白色（M）代表茅台。图2b 和2d 为基于PCA 的载荷图，2b为威士忌的载荷图，2d为白酒的载荷图，可以认为威士忌在t[1]和t[2]轴两端分布不明确，对应散点图中密度高区域较为集中，在pt[2]轴上，白酒中茅台和口子窖明显分布在t[2]轴两端，对应散点图划分两个区域明显，高密度点群分别在第一象限和第二象限中，并可以分别识别特征物质[26]。结果发现威士忌在0.2～0.4 密度范围内，存在m/z=277、m/z=321 和m/z=365 等质谱峰，其中m/z=277和m/z=321 为混合威士忌的特征峰；在0.4～1 密度范围内存在m/z=274、m/z=318 且为单一威士忌的特征峰。白酒有0.2～0.8（p1：-0.025～-0.015，p2：-0.01～0.02）和0.2～1（p1：-0.005～0.015，p2：0.015～0.025）两个高密度范围，在0.2～0.8 密度范围内存在m/z=141、m/z=317 质谱峰，且为茅台的特征峰。在0.2～1 区域存在m/z=118、m/z=136、m/z=156、m/z=258 质谱峰，其中m/z=118、m/z=156 为2013 年茅台的特征峰，而m/z=136 为不同年份茅台的特征峰，m/z=258为口子窖的特征峰。

图2 两类蒸馏酒的主成分分析及载荷图

将相关性较高的6 种特征峰做热图，如图3 所示，横坐标代表6 种主要特征峰的质荷比，纵坐标代表6 种不同蒸馏酒，颜色反映了特征质谱信号的相对强度大小，颜色越深，峰强越高，同一特征物质在不同酒中的颜色差异越大，越能用于区分酒，结果发现这6 种特征峰在6 种蒸馏酒中的含量差异较大，说明通过PCA结合散点图筛选可靠。

图3 强相关性特征物质热图

2.3 特征物质结构可视化分析

直接对全扫描结果进行数据可视化分析，数据量庞大且无重点，导致数据分析困难。范式图中存在一个特殊点，可以用来数据分析，即在O/C=0.5，H/C=1 处存在一个中心，经过该中心存在4 条特殊直线，H/C=-2(O/C)+2，O/C=0.5，H/C=2(O/C)，H/C=1，这4 条线分别代表甲基或去甲基化，氢化或脱氢过程，水合作用和脱水过程，氧化过程或还原过程，经过线的点会发生相应反应，中心点发生4 种反应[31]。如图4 所示，图中a—d 分别代表单一麦芽威士忌、混合威士忌、茅台和口子窖，图中横坐标代表碳元素与氧元素个数比，纵坐标为氢元素和碳元素个数比，颜色代表质荷比，质荷比越大，颜色越深。对比4 张图发现，单一麦芽威士忌、混合威士忌、茅台中心点比较明显，口子窖该坐标不存在物质。经分析单一麦芽威士忌中心点分子式为C2H2OS4（m/z=171），混合威士忌中心点分子式为C4H4O2S4（m/z=212），茅台中心点分子式为C2H2OS3（m/z=138），这3 个结构均不是蒸馏酒的主要特征物质，通过全扫描范式图不能直接识别出威士忌和白酒的差异性物质。

图4 4种蒸馏酒的范式图

将PCA 与载荷图分析结果得到的六种强相关性特征物质进行结构分析，得到相应的范式图，如图5 所示，H/C 和O/C 值在不同范围内代表的物质种类不同[31]，如A 区代表脂肪酸或者酯类，B 区代表苦味酸及其衍生物，这些为发酵的产物[11]。图5中不同形状标记元素组成不同，包括CHO、CHON、CHONS 3种不同元素组成形式，不同颜色标记的相对分子量不同，灰色代表m/z=136、红色代表m/z=258、蓝色代表m/z=274、绿色代表m/z=277、紫色代表m/z=318、黄色代表m/z=321。通过筛选在A、B 区域内的可能结构得到6 种主要特征物质的可能化学式信息，结果发现m/z=136 化学式可能为C8H8O2、C9H12O、C2H4N2O5、C4H12N2OS 等。m/z=258化学式可能为C14H26O4、C11H6N4O4、C11H18N2O3S，m/z=274 化学式可能为C14H26O5、C17H22O3、C18H26O2等，m/z=277 化学式可能为C5H7N7O7、C14H31NO2S等，m/z=318 化学式可能为C8H6N4O10、C17H22N2O2S，m/z=321 化学式可能为C19H31NOS。对物质结构分析可以采用质谱串级结合数据分析进行，本实验中未进行相关实验，重点关注了对质谱全扫描结果结合数据分析进行物质差异识别的方法。

图5 强相关性特征物质范式图

3 结论

本研究建立的方法可以有效区分不同类别蒸馏酒之间的差异性物质。通过全扫描获得主要特征峰，去除受不同厂家、年份影响的数据，通过PCA结合载荷图分析，筛选出相关性高的数据，进一步缩小特征物质识别范围，最后通过范式图推断特征物质分子离子峰和物质可能存在的结构。通过本方法，可以有效减少差异性物质的识别数量，降低工作量，且物质识别与分析不会局限在已识别的物质成分数据库中。对成分种类较多的物质识别提供新的可行性，对未被了解掌握的自然物质的分析起到辅助作用，同时对复杂自然物质成分筛选提供新思路。本研究建立的方法与传统分子离子串级分析的目的一致，用于推断物质化学式。区别在于本研究通过确认元素组成与不饱和键的数量可以直接推断物质结构，而串级结构分析通过研究分子离子信息、碎片离子信息以及两者之间的关系推断物质结果，推算过程复杂。本研究在实验上只需对待测物进行全扫描，无需串级分析，大量减少了碰撞气的消耗。