吕嘉伟，卢灏泽，刘振东，薛 蓓，王妍凌，杨冬莹，张海鹏，张金萍，黄 翠，薛 洁

（1.西藏农牧学院食品科学学院，西藏林芝 860000；2.中国食品发酵工业研究院有限公司，北京 100015；3.国家酒类品质与安全国际联合研究中心，北京 100015；4.西藏民族大学医学院，陕西咸阳 712082；5.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐 830052）

西藏曲拉为藏族传统奶酪[1]，是以西藏特色畜产品牦牛产生的牦牛乳为原料制备而成，由于其自然发酵的特性，曲拉中存在丰富的微生物资源，但由于缺乏工业化生产的条件，曲拉大部分以家庭手工式生产，生产规模较小、品质控制较难，限制了当地曲拉产业的发展[2]。适当改进生产工艺，在保留其原有风味的基础上，保证曲拉的安全性，使曲拉的外表更美、品质更佳，可在一定程度上加快西藏曲拉的推广。

将鲜乳生产成各类发酵乳制品离不开发酵剂，目前我国乳品企业所用的菌株大多需要进口，我国的益生菌开发应用起步较晚，拥有自主知识产权的菌种较少。传统发酵乳品中含有丰富的微生物资源，其中不乏具有优良性状的菌株，因此自然发酵乳品有一定的开发潜力。朱建宁等[4]从牦牛曲拉中筛选出的耐久肠球菌（E.durans）具有较好的耐受性，在较高的渗透压、较高的胆盐浓度、较低的pH环境下，生长较为良好，有作为益生菌的潜能；梁竟一等[5]从青海地区的乳制品中筛选出1 株瑞士乳杆菌（L.helveticus）有较好的抗幽门螺杆菌功效，可作为功能性乳品开发的专利菌株[5]；刘敏等[6]从内蒙古采集的自然发酵乳中筛选出的酵母菌X4 具有优良的耐受性，利用其制作切达奶酪，可显著改善产品的质构特性，对咀嚼性和硬度等均有所提升。

各类乳制品中分离所得的菌种，具有良好性能的菌株可进一步开发利用，以提升品质、丰富产品类型[7]。近年来，许多学者对内蒙古、新疆等地的奶制品进行了较为详尽的研究[9]，相对而言，对西藏曲拉的各方面研究较少。本研究对牦牛曲拉中含有的微生物资源进行挖掘，构建牦牛曲拉菌种资源库，筛选具有优良性状、有深入研究价值与开发潜力的菌株，为曲拉品质提升奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1 菌种、样品

菌种：大肠埃希氏菌（E.coli）CICC 20234、金黄色葡萄球菌（S.aureus）CICC 10786，由实验室从菌种保藏中心（CICC）购买。

曲拉样品：采自西藏各地的牧民家中，采样时间为2021 年3 月，所有样品均为自然发酵工艺制成。各样品采集地详情见表1。

1.1.2 试剂与耗材(表2)

表2 药品与试剂

1.1.3 仪器设备(表3)

表3 仪器与设备

1.2 试验方法

1.2.1 微生物的分离培养、鉴定

将所有曲拉样品准确称取10 g，单独分装于无菌采样袋中。酒精灯、接种环、涂布棒、一次性平板培养皿、具塞试管、1.5 mL 离心管。参照凌代文[14]的方法进行微生物的分离培养、鉴定。

1.2.2 乳酸菌发酵能力测定

凝乳时间测定：将乳酸菌活化后，按3 %接种量接种于灭菌后的脱脂乳培养基中，放置于37 ℃恒温培养箱，发酵至牛乳组织黏稠，有明显凝块，记录凝乳的时间。

发酵乳滴定酸度测定：按照GB 5009.239—2016《食品安全国家标准食品酸度的测定》，测定发酵乳的滴定酸度，平行测定3次。

发酵乳后酸度测定：将凝乳后的发酵乳放置于4 ℃，分别于1 d、7 d、14 d 测定其滴定酸度，平行测定3次。

发酵乳持水率测定：将凝乳后的发酵乳放入15 mL 离心管，4000 r/min，离心10 min，弃上清液，按以下公式计算其持水率，平行测定3次。

持水率=（M2-M0）/（M1-M0）×100%

式中：M0——空离心管的质量；

M1——离心前的总质量；

M2——弃去上清液后的总质量。

1.2.3 乳酸菌耐受性测定

菌株耐盐性能测定：将NaCl 加入MRS 液体培养基，调节培养基的盐浓度。液体培养基灭菌后接种菌株，37 ℃恒温培养24 h。在不同时间点取样并测定菌液的吸光值，波长设定为600 nm。平行测定3次。

菌株耐酸性能测定：将HCl 加入MRS 液体培养基，调节培养基的pH。液体培养基灭菌后接种菌株，37 ℃恒温培养24 h。在不同时间点取样并测定菌液的吸光值，波长设定为600 nm。平行测定3次。

菌株耐胆盐性能测定：将牛胆酸钠加入MRS液体培养基，调节培养基的胆盐浓度。液体培养基灭菌后接种菌株，37 ℃恒温培养24 h。在不同时间点取样并测定菌液的吸光值，波长设定为600 nm。平行测定3次。

菌株耐温度性能测定：将乳酸菌充分活化后，接种于MRS 液体培养基，分别放置于15 ℃、37 ℃、45 ℃的恒温培养箱，恒温培养24 h。在不同时间点取样并测定菌液的吸光值，波长设定为600 nm。平行测定3次。

1.2.4 乳酸菌抑菌能力测定

将大肠杆菌（E.coli）和金黄色葡萄球菌（S.aureus）活化后，按1 %的接种量接种于LB 固体培养基，充分摇匀后将添加菌液的LB 培养基倒入灭菌后的平板，平板凝固后，用无菌镊子放置牛津杯，向牛津杯中加入100 µL 活化好的乳酸菌液，37 ℃恒温培养48 h。观察平板上是否产生抑菌圈，有抑菌圈的测定其直径长度。

2 结果与分析

2.1 细菌鉴定结果与系统发育分析

经过分离纯化后，共得到42 株乳酸菌，部分菌株的PCR 扩增产物电泳图、平板照片如图1、图2所示。

图1 乳酸菌PCR产物凝胶电泳图

图2 部分乳酸菌平板照片

从图1 可以看出，所有菌株的特异性片段分子量在1500 bp 左右，条带清晰，表明菌株DNA 提取与PCR扩增均成功，可进行下一步测序分析。由图2 可知，乳酸菌在MRS 平板上的菌落较小、形态为圆形、表面光滑、边缘整齐、菌落颜色为乳白色，在加了CaCO3的MRS平板上有明显的溶钙圈。

表4 显示了所分离菌株的鉴定结果，其中肠膜明串珠菌（L.mesenteroides）11 株、假肠膜明串珠菌（L.pseudomesenteroides）5 株、肠膜明串珠菌右旋葡聚糖亚种（L.mesenteroides subsp.dextranicum）4 株、粪肠球菌（E.faecalis）10 株，植物乳杆菌（L.plantarum）4株、乳酸片球菌（P.acidilactici）4 株、布氏乳杆菌（L.buchneri）2株、类肠膜魏斯氏菌（W.paramesenteroides）2 株，共有5 个属、7 个种，共计42 株乳酸菌。

表4 乳酸菌序列比对结果

图3 为部分菌株的系统发育树，详细显示了各菌株间的分类关系，可直观的看出各菌株间亲缘性关系。在发育树中，不同属的乳酸菌被分为3 个分支，乳杆菌属（Lactobacillus）、片球菌属（Pediococcus）在同一分支，乳球菌属（Lactococcus）、肠球菌属（Enterococcus）在同一分支，明串珠菌属（Leuco-nostoc）、魏斯氏菌属（Weissella）在同一分支，同一属不同种的乳酸菌在系统发育树上的位置相近。

图3 部分菌株16S rRNA序列构建的系统发育树

2.2 乳酸菌发酵能力

凝乳状态是奶酪质量最直接的指标，凝乳时间是评价乳酸菌性能的重要指标，本研究比较了不同乳酸菌的凝乳时间，结果如表5所示。

表5 不同菌株的凝乳时间

将所有乳酸菌接种于脱脂乳中进行发酵试验，以筛选发酵时间适中的菌株，发酵时间过短，菌株产酸过快，发酵乳的风味形成不完全，发酵时间过长，菌株产酸能力较弱，虽对风味形成有一定贡献，却增加了生产成本[15]。各菌株的凝乳时间如表5所示，不同菌株的凝乳时间在13～24 h 之间，一般商业化乳酸菌制造发酵乳的发酵时间为6～10 h，是因为其活性较高、且由多种菌复配而成。因此选取不同菌属中凝乳时间较短，产酸能力较强的8 株菌，分别为LZM-1、LZM-5、SNM-5、RKZM-1、RKZM-5、NQM-1、ALM-1、ALM-3，将以上菌株进行后续的滴定酸度测定、持水率测定、耐受性试验、抑菌能力试验。各菌株滴定酸度变化结果如表6所示。

表6 不同菌株滴定酸度变化 (°T)

表6 为初筛菌株所制备发酵乳滴定酸度变化情况，结果显示，LZM-1、ALM-1、ALM-3、RKZM-5 产酸能力较强，ALM-3 的后酸化程度较高，贮藏14 d 后滴定酸度增长了34.42°T±2.64°T，后酸化能力较强的菌株不利于酸乳的贮藏。因此，LZM-1、ALM-1、RKZM-5有作为乳制品发酵剂的潜能。

表7 为初筛菌株所制发酵乳持水率的变化情况，持水率越高，表示发酵乳越黏稠，组织状态较好。LZM-1、ALM-1、RKZM-5 的持水率在贮藏过程中变化不大，ALM-3 的持水率在贮藏的前7 d 逐步增加，在14 d下降明显，原因是其酸度不断上升，酸乳质地崩解，持水率下降。

表7 不同菌株持水率变化 （%）

2.3 乳酸菌的生长曲线

在MRS 液体培养基中接种活化好的乳酸菌，将培养基放置于恒温培养箱中培养，培养温度为37 ℃。每间隔2 h，利用酶标仪测定菌液在600 nm处的吸光值，结果如图4所示。

图4 初筛菌株的生长曲线

图4 显示所有菌株在4 h 后进入对数生长期，OD 值增长迅速，在16 h 后进入稳定期，OD 值增长幅度不大，无明显变化。在达到稳定期后，LZM-1有最高的吸光值，生长最为旺盛，SNM-5 的吸光度值最低，生长情况不如其他菌株。

2.4 乳酸菌耐受性结果

盐渍是许多奶酪生产工艺中重要的一步，加盐可促进奶酪内部乳清的排出、增加奶酪的硬度，还可以改善奶酪的风味，防止杂菌对奶酪造成污染[16]。因此用于生产奶酪的菌种应具有一定的耐盐性。

图5 为8 株乳酸菌的耐盐性能测定结果，随着NaCl 浓度的增加，菌株的生长逐渐受到抑制，随着培养时间的增加，菌株的生长逐渐恢复。所有菌株都可以在7 % NaCl 环境下生长，具有一定的耐盐特性。

图5 不同菌株耐盐性能

乳酸菌为发挥其益生作用，需先经过胃，然后在人体肠道内定殖，因此需要具有一定的酸耐受性与胆盐耐受性，商业化的益生菌必须具有良好耐酸耐胆盐性能[17]。图6 为8 株乳酸菌的耐酸性能测定结果，所有菌株在pH6.5 的条件下生长迅速，在pH4.0的条件下生长受到抑制，但仍能正常生长，在pH3.0、pH2.0 的条件下，所有菌株的OD 值几乎不增加，菌株不能正常生长。所筛选的8 株乳酸菌均能耐受pH4.0的条件，耐酸性能较为良好。

图6 不同菌株耐pH性能

图7 为8 株乳酸菌的耐胆盐性能测定结果，胆盐对乳酸菌的抑制作用较为明显，培养基中胆盐浓度为0.1 %时，所有菌株的OD 值下降十分迅速，ALM-3、LZM-1、RKZM-1、SNM-5 的生长较好于其他菌株；胆盐浓度为0.3%时，RKZM-5 的OD 值尚有增加；胆盐浓度为0.5%时，所有菌株的OD 值增长均不明显。通常人体肠道内含有0.3%以下的胆盐。所有菌株都可耐受0.1 %浓度的胆盐，具有一定的胆盐耐受性。

图7 不同菌株耐胆盐性能

在乳制品的生产发酵过程中，根据产品需要设定相应的发酵温度，部分菌株的发酵温度较高，因此乳酸菌对较高的温度应有一定耐受性，在奶酪的成熟过程中，贮藏室的温度较低，乳酸菌应该在较低温度下可以正常生长[18]。如图8 所示，所有菌株在45 ℃下均可正常生长，但其活性不如生长在37 ℃的菌株。LZM-5、RKZM-5 在15 ℃生长较为缓慢，其余菌株在15 ℃生长初期较为缓慢，延滞期较长，在12～24 h 时生长速度加快，最终生长良好。综上所示，所有乳酸菌在37 ℃下生长良好，在45 ℃也可正常生长，在15 ℃下LZM-5、RKZM-5生长十分缓慢，其他菌株可正常生长。

图8 不同菌株在不同温度的生长情况

2.5 乳酸菌抑菌能力

奶酪在成熟贮藏等过程中，需要存放较长时间，在此期间内易受各种杂菌污染，奶酪中的乳酸菌具有天然的抑菌效果，可有效抑制各种致病菌的生长，以保证奶酪在贮藏期间的安全性[19]。本研究分析了8 株乳酸菌对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果，结果如表8所示。

表8 乳酸菌抑菌圈直径 (mm)

由表8、图9 显示，乳酸菌的抑菌圈直径越大，对致病菌的抑制效果越好。8株乳酸菌都对最常见的两种致病菌有一定的抑制效果。植物乳杆菌LZM-1和ALM-1，布氏乳杆菌ALM-3对这两种常见致病菌的抑制效果均较好，肠膜明串珠菌SNM-5 和NQM-1 的抑菌效果则相对较差一些。抑菌效果更好的菌株有一定的益生潜能。

图9 部分菌株的抑菌圈

3 结论

通过对乳酸菌进行发酵试验初步筛选出8 株凝乳时间较短的乳酸菌，测定8 株乳酸菌的滴定酸度与持水率，LZM-1、ALM-1、RKZM-5 的后酸化能力较弱，在贮藏14 d 内，滴定酸度与持水率的变化率较小。耐受性结果显示，可耐受7 % NaCl 浓度、pH4.0 酸性条件、0.1 %胆盐浓度，并且可在15 ℃与45 ℃环境中生长，对大肠杆菌与金黄色葡萄球菌有明显的抑制效果，所筛选菌株有进一步挖掘开发的潜力。

乳酸菌按照其在乳制品中的作用，可分为发酵剂乳酸菌和非发酵剂乳酸菌，发酵剂乳酸菌多为乳杆菌属（Lactobacillus）或乳球菌属（Lactococcus），在牛乳中产酸速率高，可促进凝乳。非发酵剂乳酸菌在奶酪生产过程中产酸作用弱或不产酸，主要起加快奶酪成熟、改善奶酪风味的作用[20]。一些嗜温型乳酸菌如明串珠菌属（Leuconostoc）、肠球菌属（Enterococcus）等在奶酪成熟过程中作为产香菌，可加快成熟并产生风味物质，对奶酪的整体风味起修饰作用[21]。以上各种微生物均在西藏曲拉中占有较高的丰度，这些微生物共同发酵制成曲拉。曲拉作为我国传统发酵食品，自然发酵的方式赋予了曲拉独特的风味，同样有可能使致病菌生长繁殖，导致其安全性受到严重影响。因此，探明发酵过程中的关键微生物，对优良菌种进行工业化应用，对保证曲拉安全性、改善曲拉风味与品质等具有重要意义。