李晓龙，张文亮,2，官萌娇，刘 冰，管圆圆，任爱芝，赵培宝*

（1.聊城大学农学院，山东聊城 252000；2.莘县自然资源和规划局，山东莘县 252000）

聊红椿是我们团队经过多年选育得到的红果臭椿新品种（证书号：20190262），翅果颜色鲜红，灿烂如霞，具有较高的观赏价值和广阔的推广前景[1]。红果臭椿是臭椿的一个变种，大型落叶乔木，对土壤的适应力强，可以改善环境，不仅果实艳丽，而且木材优良，用途广泛，是城乡绿化的优良树种[2]。

王教敏调查采集臭椿的病样组织进行分离观察，经过致病性测定发现炭疽病的致病菌致病性强，严重影响臭椿的生长，降低臭椿的价值[3]。王树和等在河南省的调查发现臭椿炭疽病主要为害叶片，病斑呈圆形褐色，经过病斑组织分离、形态学观察、柯赫氏验证、多位点基因系统发育分析发现炭疽病的致病菌是果生炭疽菌[4]。有很多植物都会得炭疽病，韩小勇等采用柯赫氏法则对紫山药炭疽病病斑组织进行分离，对病原菌进行鉴定，得到6 株致病菌，不同的致病菌致病力不同，其中致病力最强的是暹罗炭疽菌[5]。张世才等通过对重庆加工型辣椒的炭疽病进行调查，并对病原菌进行分离和鉴定，确定致病菌为胶孢炭疽菌，并进行了毒力测定找到了防治辣椒炭疽病的有效药剂[6]。

本研究于2020年在聊城大学生态园采集病叶，经分离纯化得到一种炭疽菌，进一步经致病性测定、形态学及分子鉴定，确定炭疽病的致病菌是暹罗刺盘孢（Colletotrichum siamense），该研究结果为聊红椿炭疽病防治奠定了基础，也可为聊红椿的推广提供帮助。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在2020 年8—10 月在聊城大学植物园内采集聊红椿叶部病害样本；致病性测定供试健康幼苗是实验室培养的聊红椿幼苗，生长时间120 d，健康无病害，长势一致。真菌培养采用PDA 培养基，所用化学药品为国产分析纯，分子试剂购自泰安联星公司。

1.2 仪器与设备

超净工作台、上海博讯BSG-250 光照培养箱、高压蒸汽灭菌锅、PCR 仪、Olympus 光学显微镜、恒温水浴锅、培养皿等。

1.3 病原菌的分离和纯化

聊红椿叶部病斑分离采用组织分离法。用无菌水对刚采集的新鲜病叶进行清洗，用解剖刀从叶片病健交界处切取数块边长为5 mm 正方形病组织[7]。将叶片生病组织分别放入75%的酒精中2～3 s，以达到表面消毒和淋湿组织表面目的，然后用5%次氯酸钠对叶片表面消毒3～5 min，放入含有无菌水的培养皿中清洗3 遍，用无菌的吸水纸去掉组织表面水分。用灭菌的镊子将材料移入PDA 培养基，每皿放5 片，将培养皿翻转放入25 ℃培养箱培养。等到培养皿材料边缘长出菌丝物，用接种针进行单胞分离来纯化病原菌，直至培养出整齐一致的单个菌落[8]。

1.4 病原菌的形态学鉴定

菌落形态观察，在超净工作台上将分离纯化好的菌丝接种于PDA 培养皿上，在25 ℃培养箱倒置培养，每天观察记录菌落的形态特征[9]，用相机记录菌落颜色变化；形态特征显微观察，用无菌针挑取少量病原菌制成临时载玻片，在显微镜下观察菌丝是否有隔、分生孢子的大小、颜色变化等形态特征[10]，记录并拍照。

1.5 病原菌的分子生物学鉴定

收集菌丝，采用OMIGA 公司的DNA 试剂盒提取病原菌DNA[11-13]，然后进行PCR 扩增，回收扩增片段，由济南博尚公司进行测序，最后进行序列分析。ITS引物为通用引物（见表1）。

表1 ITS引物

PCR 反应程序为：预变性94 ℃，5 min；然后每循环为94 ℃，30 s；50 ℃，45 s；72 ℃，45 s，32 个循环；继续72 ℃，延伸5 min，反应结束后电泳检测。表2为PCR扩增体系。

表2 PCR扩增体系

电泳检测正确后切胶回收目的条带，方法为在凝胶成像系统下用刀片切下目的条带，移至离心管（1.5 mL），采用DNA 凝胶回收试剂盒胶回收DNA 片段[14]。将纯化回收后扩增片段送济南博尚生物技术有限公司测序。

将测序公司反馈的有效序列在NCBI 网页进行BLAST同源性比对，选取同源序列DNA 序列，构建系统发育树，根据亲缘关系来判断菌株所属真菌种类[15-16]。

1.6 病原菌的致病性鉴定

采用柯赫氏法则进行致病性测定[17-18]，方法为在超净工作台上，用无菌打孔器打取5 mm 的圆形菌饼若干，将菌饼小心的贴合在健康无病害、长势一致的聊红椿幼苗叶片上，每棵幼苗选取3 个叶片处理，同时放置空白PDA 菌饼的叶片作为对照，每组3 棵重复。贴合完用透明袋遮住整棵幼苗，放到25 ℃环境下培养，每天记录观察幼苗发病情况并拍照。对出现病斑叶片的幼苗，观察其发病症状是否与接种植物的症状一致，并再次从病叶上病健交界分离纯化致病菌，与从大田分离到的病原菌进行对照。

2 结果与分析

2.1 聊红椿叶部病害田间症状

对聊城大学生态园中的聊红椿叶部病害进行了田间症状观察，发现炭疽病是其重要病害之一，主要为害叶片。发病初期叶片颜色由绿转为红色，在叶尖及叶缘形成大小不同的褐色病斑，呈不规则形状，如病情较重则叶部病斑极易碎裂、脱落，形成穿孔症状（见图1）。病害也易造成叶片提早脱落，影响树势。

图1 聊红椿叶部病害的田间症状特征

2.2 病原菌的分离与形态学鉴定

采用组织分离法分离聊红椿叶部病害病原菌[19]，得到多个病原菌株，其中A2 菌株从菌落形态初步判定属于炭疽病菌，菌株在28 ℃条件下生长良好，产生白色菌丝，向四周辐射状生长（见图2a），随着培养时间延长，慢慢形成圆形菌落，经7～8 d 长满培养皿（见图2b）。

图2 菌株A2形态特征

初期菌丝为白色絮状，菌丝绒毛状茂盛浓密，菌落边缘光滑规则。培养15 d 后菌落颜色变暗，形成橘红色的团状物质，这就是病原菌的分生孢子梗与分生孢子（见图2c）；在显微镜下检测观察到菌丝有隔，分生孢子是长椭圆形单胞，两端钝圆（见图2d）。

2.3 病原菌的分子学鉴定

采用DNA提取试剂盒提取菌株的DNA，利用引物ITS4/ITS5 对真菌的DNA 扩增rDNA-ITS 序列，通过1%琼脂糖凝胶电泳可检测到清晰的条带，菌株A2 的rDNA-ITS 序列大小在600 bp 左右条带（见图3），符合进一步的测序条件。

图3 菌株A2的rDNA-ITS扩增片段电泳

经过测序得到了A2 菌株的ITS 序列，将获得的ITS 序列在NCBI 网站上进行BLAST，将菌株A2 的相应序列与所得到的同源性较高的部分序列进行比对，构建系统进化树，如图4 所示，菌株A2 的rDNA-ITS序列与暹罗刺盘孢（登陆号：MW322808.1）同源性最高，达到100%，结合菌株A2的各种形态分析结果，综合鉴定致病菌A2是暹罗刺盘孢。

图4 菌株A2的rDNA-ITS序列构建的发育树

2.4 病原菌的致病性鉴定

将分离到的暹罗刺盘孢菌饼放置到聊红椿健康叶片4 d 后（见图5a），病斑开始在叶片与菌饼接触的边缘长出。接种7 d后将菌饼去除（见图5b、图5c），病斑清晰可见，随着侵染时间增加，病斑面积逐渐扩大，对比田间症状发现生成的病害症状特点和聊红椿炭疽病病情一致，表明暹罗刺盘孢是聊红椿炭疽病的病原菌。

图5 暹罗刺盘孢菌致病性测定

3 结论与讨论

红果臭椿作为臭椿中的一个新品种，适应性好、树形美观，每年夏季果实红艳让人赏心悦目，观赏价值很高，极具市场开发前景，是庭院绿化和街道美化的良好树种[20-24]。但是在聊城大学生态园观察到聊红椿叶片在多雨季节易于感染叶部病害，产生病斑，严重的还会导致叶片脱落，影响树木的生长与观赏性[25]，值得深入研究，本研究通过对叶部病害病原菌的分离鉴定初步确定为炭疽病。

炭疽病是一种重要的真菌病害，寄主范围广，对植物的危害很大，已在多种植物上报道了炭疽病，例如山药炭疽病[26]、葡萄炭疽病[27]、广西油茶炭疽病[28]、芒果炭疽病[29]等。暹罗刺盘孢是炭疽病病原菌的一种，暹罗刺盘孢引起的植物炭疽病也已有报道，例如曹雪仁等对海南橡胶树暹罗刺盘孢菌遗传结构进行了分析[30]；徐丹丹等从美丽崖豆藤分离鉴定了暹罗刺盘孢菌[31]；李河等鉴定到油茶炭疽病是由暹罗刺盘孢菌引起的[32]。炭疽病是一种真菌，对真菌的分离鉴定一般是通过病原菌分离形态学观察[33-34]、致病性鉴定[35]、分子生物性鉴定[36]等途径来确定，特别是对于近似种较多的炭疽菌需要结合形态学和分子生物学来进行区别鉴定。

本研究通过病原菌分离与形态学鉴定，观察到菌丝为白色絮状，菌丝绒毛状茂盛浓密，菌落边缘光滑规则，后期形成橘红色的团状物质，分生孢子是长椭圆形单胞，两端钝圆，与李文等描述的百日草炭疽病菌特征相似，初步确定为炭疽病[37]。经致病性测定和分子生物学鉴定，菌株A2 的rDNA-ITS 序列与暹罗刺盘孢（登陆号：MW322808.1）同源性达到100%，最终确定引起聊红椿炭疽病的病原菌是暹罗刺盘孢菌。本研究结果为聊红椿炭疽病的防治和新品种快速推广奠定了基础。