纳菲沙·卡德尔, 阿依西布·萨吾提, 钟 莉, 库热西·玉努斯

(新疆医科大学1基础医学院, 2药学院, 乌鲁木齐 830017; 3新疆地方病分子生物学重点实验室, 乌鲁木齐 830054,4浙江大学医学院公共技术平台, 杭州 310000; 5新疆医科大学维吾尔医学院, 乌鲁木齐 830017)

全球30～79岁的高血压患者人数自1990年至2019年由6.48亿增加到12.78亿[1]。虽然近年来高血压的治疗已经取得了进展,但对高血压患者血管并发症的新疗法开发仍然是至关重要的研究方向[2]。高血压是遗传和环境因素共同起作用的复杂性疾病。慢性应激在高血压发生发展中起重要作用[3],但其具体病理生理学机制仍不清楚。大量研究表明,内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)参与高血压、动脉粥样硬化、血管钙化、缺血性心脏病及心力衰竭等多种心血管疾病(Cardiovascular disease, CVD)的发生和发展,可作为治疗多种CVD的重要靶点[4-6]。ERS信号通路的研究可能为开发高血压新疗法和预防其并发症提供重要的依据。

课题组前期研究发现,应激性高血压(Stress induced hypertension,SIH)大鼠模型中ERS标志分子葡萄糖调节蛋白78(Glucose-regulated protein 78/binding immunoglobulin protein,GRP78/BiP)的表达水平上调[7],初步证实SIH模型中ERS的存在。ERS的发生进而激发未折叠蛋白质反应(Unfolded protein response,UPR),激活其下游信号分子[4]。IRE1/XBP1通路是UPR三个重要信号通路之一[8]。X盒结合蛋白1(X-box binding protein-1,XBP1)作为核转录因子调控其下游基因mRNA表达水平。肾素-血管紧张素-醛固酮系统与高血压发生密切关联,其相关基因血管紧张素转化酶(Angiotensin-converting enzyme,ace)和ANGII受体1型(ANGII type 1 receptor,at1r)的启动子区均存在潜在的XBP1应答元件[9]。

中药复方缓压乐(HYL)是由本科研团队根据民间降压验方组合而研制的。用HYL进行干预后,SIH大鼠收缩压和舒张压降低[10],但其具体机制不明,因此本研究在建立SIH大鼠模型的基础上,用HYL进行干预,探讨ERS信号通路相关蛋白的表达变化,为高血压中药防治提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 36只鼠龄为6～8周的SPF级Wistar大鼠,体重160～220 g,购买及饲养于新疆医科大学动物实验中心[SCXK(新)2016-0003]。

1.1.2 主要试剂与仪器 受磷蛋白(phospholamban,PLB)总蛋白、p-PLB、p-肌醇需求因子1(inositol-requiring enzyme 1,IRE1)及XBP1抗体(abcam,英国),DAB显色试剂盒(陆壹科技,北京),免疫组化试剂盒(博士德生物,武汉),BCA试剂盒(索莱宝,北京),BSA封闭液(博士德生物,武汉),ECL化学发光底物(Biosharp,中国),无创血压仪BP-600A(泰盟有限公司,成都),倒置显微镜(莱卡公司,德国)。

1.1.3 药物 中药复方缓压乐主要药物成分有倒提壶、玫瑰花、小茴香等,药材均购自新疆维吾尔医院。依普利酮片是一种新型的具有选择性阻断醛固酮受体的阻断剂,有良好的降血压作用。

1.2 方法

1.2.1 SIH模型制备 36只Wistar大鼠中随机取6只作为正常组(不建模),剩余30只随机分为模型组,高、中、低剂量药物干预组和阳性对照组,每组6只,参照文献[11]造模12周,造模期间使用无创血压仪测定各组大鼠尾动脉收缩压(Systolic blood pressure,SBP)和舒张压(Diastolic blood pressure,DBP),每只大鼠测3次血压,取平均值。以模型组12周应激刺激结束后测得的血压与应激刺激开始前的初始血压进行比较,收缩压升高≥20 mmHg说明造模成功[12]。

1.2.2 动物给药方法 高、中、低剂量药物干预组和阳性对照组在给予间断足底电和噪声复合刺激的同时予以相应药物干预12周。模型组大鼠每天灌胃蒸馏水(0.1 g/100 g体质量,1次/d),HYL药物干预高剂量组(0.1 g/100 g体质量,1次/d)、中剂量组(0.05 g/100 g体质量,1次/d)、低剂量组(0.025 g/100 g体质量,1次/d)大鼠每天灌胃HYL。阳性对照组大鼠每天灌胃依普利酮溶液(0.005 g/100 g体质量,1次/d)。

1.2.3 收集样本 取大鼠胸主动脉组织并分两段,一段置于-80℃冰箱保存,备用于RT-qPCR及Western blot实验。另一段放入包埋盒中固定于4%多聚甲醛溶液中,石蜡包埋,用于免疫组织化学(IHC)实验。

1.2.4 RT-qPCR技术检测胸主动脉组织ace和at1rmRNA表达水平 液氮研磨适量胸主动脉组织,使用Trizol试剂提取总RNA,测定其浓度,使用PCR循环仪进行逆转录。用RT-qPCR定量检测ace和at1rmRNA表达量,用2-ΔΔCt分析法计算结果,引物序列见表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.2.5 IHC技术检测胸主动脉组织中XBP1的表达 将石蜡切片常规脱水,3%过氧化氢去除内源性酶,柠檬酸钠修复抗原,5%BSA封闭液封闭,滴加一抗4℃过夜,HRP-山羊抗兔IgG30 min 37℃孵育,DAB显色(显微镜下控制显色时间),苏木素复染,脱水、透明、中性树胶封片。荧光倒置显微镜下观察拍照,每只大鼠选取6张切片,每张切片随机选4个视野。采用Image Pro Plus6.0软件定量分析,计算各组大鼠累积光密度值(IOD),进行统计分析。

1.2.6 Western blot技术检测胸主动脉组织PLB总蛋白、p-PLB、p-IRE1及XBP1的表达水平 液氮中研磨适量胸主动脉组织,加入RIPA裂解液提取蛋白。在4℃条件下,12 000 r/min离心10 min,取上清液,使用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。适宜条件下,进行电泳、转膜、封闭、一抗孵育,二抗孵育等步骤。ECL化学发光试剂曝光显影,Image J图像分析法进行灰度值分析。

1.3 统计学分析采用SPSS21.0软件进行数据统计分析,计量资料用均数±标准差表示,计量资料服从正态性时,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析;当计量资料不服从正态性时,组间比较采用秩和检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠尾动脉血压的变化造模前,各组大鼠收缩压和舒张压无明显差异(P>0.05);造模12周结束后,与正常组相比,模型组、HYL药物干预中及低剂量组大鼠SBP和DBP升高(P<0.05),高剂量组与阳性对照组大鼠与正常组比较,SBP和DBP变化差异无统计学意义(P>0.05);与模型组相比,高剂量组与阳性对照组大鼠SBP和DBP降低(P<0.05),见图1。

2.2 各组大鼠胸主动脉组织ace、at1r基因mRNA表达水平的变化与正常组相比,模型组大鼠胸主动脉组织ace和at1r基因mRNA表达水平均上调;与模型组相比,高、中、低剂量组和阳性对照组大鼠胸主动脉组织ace基因mRNA表达水平均下调(P<0.05),高剂量组和阳性对照组大鼠胸主动脉组织at1r基因mRNA表达水平均下调(P<0.05),见图2。

注:与正常组比较, *P<0.05;与模型组比较, ΔP<0.05。

注:与正常组比较, *P<0.05; 与模型组比较, ΔP<0.05。

2.3 各组大鼠胸主动脉组织XBP1蛋白表达水平变化IHC染色中XBP1蛋白阳性表达定位于细胞核和/或细胞质,呈棕黄色,见图3。与正常组相比,模型组和低剂量组大鼠胸主动脉组织血管平滑肌细胞中XBP1蛋白总表达量明显增多(P<0.05);相对于模型组,高剂量组和阳性对照组中XBP1蛋白染色淡、阳性表达低,且总表达量明显减少(P<0.05),中、低剂量组无明显差异(P>0.05),见表2。

注: A, 正常组; B, 模型组; C, 高剂量组; D, 中剂量组; E, 低剂量组; F, 阳性对照组。

表2 各组大鼠胸主动脉组织XBP1蛋白表达水平变化

2.4 各组大鼠胸主动脉组织总PLB、p-PLB、p-IRE1、XBP1表达水平相较于正常组,模型组、中及低剂量组总PLB、p-IRE1、XBP1表达量均明显上调(P<0.05),p-PLB表达量明显下调(P<0.05);与模型组相比,高剂量组及阳性对照组中总PLB、p-IRE1、XBP1表达量均明显下调(P<0.05),而p-PLB表达量明显上调(P<0.05)。与正常组相比,模型组、中及低剂量组p-PLB/总PLB显著下降(P<0.01);与模型组相比,高剂量组及阳性对照组p-PLB/总PLB显著增加(P<0.01),见图4。

注: 与正常组比较, *P<0.05, **P<0.01; 与模型组比较, ΔP<0.05, ΔΔP<0.01。

3 讨论

长期处于模拟的应激刺激环境中,实验动物会出现呼吸、心跳加快、血压升高等“预警反应”,导致神经-内分泌-免疫系统紊乱,内稳态失衡,最终引发SIH的发生[13]。本研究发现,慢性电击和噪声刺激会引起大鼠SBP和DBP明显上升,造模成功。用HYL干预后血压明显下降,以高剂量组尤为显著。

内质网是极其敏感的细胞器,参与胞内蛋白质折叠和分泌、跨膜蛋白易位、钙稳态和脂质生物合成等多种重要的细胞功能。非磷酸化的PLB抑制肌浆网钙ATP酶(Sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase,SERCA)的活性,减弱肌浆网钙回收作用[14]。[Ca2+]ER持续性降低是引起ERS的诱因之一。各种生理或病理刺激导致错误折叠和未折叠蛋白在内质网腔内积累,引起ERS[15]。本研究结果显示,PLB总蛋白的表达上调且PLB磷酸化水平下调,提示PLB非磷酸化水平升高,即对SERCA活性起抑制作用,是SIH大鼠血管组织发生ERS的可能原因。HYL通过反向调节PLB总蛋白表达量及PLB磷酸化水平、增加SERCA活性,进而缓解ERS的发生。

ERS的发生进而激发UPR,激活其下游信号分子[4]。IRE1作为UPR目前已发现的三个分支之一,从酵母到哺乳动物都是最保守的,具有丝氨酸或苏氨酸蛋白激酶和核糖核酸内切酶功能[4]。在应激状态下,IRE1从GRP78解离,使自身磷酸化,触发核糖核酸内切酶功能,引发XBP1 mRNA的非常规胞质剪接。未剪接的XBP1(XBP1u)不包含转录激活域,经由IRE1剪去26个核苷酸后移码导致有效的转录因子——XBP1的生成[16]。XBP1被移位至细胞核中启动转录,上调与蛋白质折叠、内质网相关降解(ER-associated degradation,ERAD)及内质网生成有关的基因表达[4,17]。Choi等[18]的研究发现,在自发性高血压大鼠中,IRE1、XBP1表达上调,并用ERS抑制剂牛磺熊去氧胆酸(Tauroursodeoxycholic acid,TUDCA)后其表达下调,且降低大鼠动脉收缩压。本研究发现,XBP1在SIH模型组大鼠胸主动脉组织平滑肌细胞中高表达,而在HYL高剂量组中低表达。在SIH模型组中IRE1磷酸化水平及XBP1蛋白表达水平上调,而在HYL高剂量组中下调,提示在SIH模型中IRE1/XBP1信号通路处于活化状态,高剂量HYL抑制此信号通路相关蛋白表达水平。有学者发现[9],在ace及at1r基因启动子区均存在潜在的XBP1应答元件。IRE1/XBP1通路激活与ACE/ANGII/AT1R轴各成份在转录和蛋白质水平上上调表达有关。高剂量的中药复方缓压乐可以通过抑制该通路,降低肾素-血管紧张素-醛固酮系统相关基因ace和at1r的mRNA表达水平,进而起到降低血压的作用。

综上所述,中药复方缓压乐通过调节由慢性应激因素引起的SIH大鼠血管组织PLB的活性、且抑制IRE1/XBP1信号通路相关蛋白表达水平,降低血管组织ERS,从而发挥防治高血压的作用,但是鉴于高血压病理生理过程及其中药复方干预机制的复杂性,有待进一步深入研究。