赛力克阿拉·阿里汗, 曹仕辰, 木合布力·阿布力孜, 麦合苏木·艾克木,艾克白尔·买买提, 赵婷婷

(新疆医科大学1药学院, 2维吾尔医学院, 乌鲁木齐 830017)

白癜风是一种由于黑素细胞功能异常、黑色素减少的皮肤常见疾病,流行病学调查显示,在世界范围内的患病率约为0.5%～2%[1]。该病可发生在任何年龄段,且发病与种族、性别无关[2],其中青少年发病率最高,约占总白癜风患者的32%～40%[3]。白癜风发病部位不定,当出现在面部、颈部和手部等部位时,会对患者造成不同程度的精神压力,甚至产生抑郁心理,影响正常社交,白癜风疾病还可导致银屑病、斑秃、慢性荨麻疹及甲状腺疾病等其他免疫疾病[4-9]。白癜风作为疑难杂症,易诊难医,需要长期综合治疗,治疗成本高,治疗有效率低[10]。复方菝葜-丹参擦剂(又名石榴皮菝葜提取液,国家发明专利号:ZL201711230949.0)是临床实践中应用的经验配方制剂,由菝葜、丹参、鸡血藤等8味中药组成,具有祛风除湿、活血解毒的功效,适用于外感风邪,湿毒阻络所致的白癜风的治疗。本配方因不同于一般外用制剂,对皮肤无任何刺激性,不产生皮损,适合于眼睑、口腔周围和粘膜等部位白癜风的治疗。复方菝葜丹参擦剂的成分复杂,治疗白癜风的物质基础研究较少,作用机制尚未清晰。本研究利用中药网络药理学和分子对接技术,探究复方菝葜丹参擦剂治疗白癜风的作用机制,通过体外促进黑色素形成实验对其功效进行实验验证,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器Heracell CO2培养箱(美国Thermo公司),IX73倒置显微镜(日本Olympus 公司),MultiskanGO酶标分析仪(美国Thermo公司)。

1.2 试药丹参、菝葜、鸡血藤、土茯苓、红花、石榴皮等中药材饮片均购自乌鲁木齐市百草堂药店。氢氧化钠(天津致远试剂有限公司,2021101018),0.25%胰蛋白酶(美国Gibco公司,25300062),甲氧沙林(8-MOP, 重庆华邦制药有限公司,H50021839),DMEM 高糖培养基(美国 Sigma公司,AF29561079),胎牛血清(美国 Sigma公司,1644044),左旋多巴(L-dopa,阿拉丁试剂公司,D2116196),曲拉通X-100(天津化工研究所,20200605),细胞培养级二甲基亚砜(DMSO,美国Sigma公司),芒柄花素(维克奇生物科技有限公司,wkq22053108),木樨草素(维克奇生物科技有限公司,wkq22032309),消白酊擦剂(安徽徽本堂生物科技有限公司,20210607)。

1.3 细胞A375黑色素瘤细胞购自中科院上海细胞所。

1.4 方法

1.4.1 复方中药材主要成分及成分对应靶点的收集及筛选 利用TCMSP(https://old.tcmsp-e.com/)数据分析平台,以类药性(Drug-likeness,DL)≥.18作为筛选指标,筛选出菝葜丹参复方中中药材各类成分;并通过活性成分筛选出成分对应的作用靶点,合并去重。通过UniProt(https:/www.uniprot.org)数据库将其靶点名称转化为相应的基因symbol。

1.4.2 治疗白癜风潜在作用靶点的筛选 通过GEO(htpps://www.ncbi.nlm.nih. gov/pubmed/)平台输入“vitiligo”作为关键词,搜索到GSE75819基因芯片为15名白癜风患者与15名正常人基因差异比较,符合筛选条件。对筛选的基因芯片进行整理,样品分组后通过R语言的Limma包和pheatmap包,进行运算和分析,筛选 LogFC的绝对值及校正后的P值获得白癜风差异基因,其中 Log FC 的绝对值>1,P<0.05。对筛选出的基因进行差异分析,对差异基因绘制火山图及基因热图,并将差异基因同TTD(http://db.idrblab.net/ttd)、OMIM(http:// www.Omim.org)、Drug Bank( https://www． Drugbank.ca)、及Gene Card(https://www.genecards.org)等数据库搜索出的白癜风相关基因靶点合并去重,运用Uniprot数据库对其进行蛋白名称标准化。将药物成分对应靶点与疾病靶点映射取交集,绘制venn图,二者的交集作为菝葜丹参复方治疗白癜风的潜在作用靶点。

1.4.3 活性成分-作用靶点网络的构建 将整理好的菝葜丹参复方中药材活性成分及筛选出的潜在作用靶点文件导入 Cytoscape 3.8.0软件,建立复方与疾病的“活性成分-作用靶点”网络,其中节点(Node)代表活性成分及作用靶点,边(Edge)代表活性成分与作用靶点的相互作用。通过CytoNCA程序,以连接度作为指标筛选出菝葜丹参复方治疗白癜风排名20的活性成分。

1.4.4 蛋白相互作用(PPI)网络的构建 通过 String平台(https://string-db. org/ cgi/input.pl)建立菝葜丹参治疗白癜风潜在靶点之间的互作网络。参数物种选择“智人”,最低要求交互作用程度“Minimum required interaction score”选择中等置信度“Medium confidence(0.900)”,其他参数保持默认数值,建立潜在靶点相互作用网络,并利用Cytoscape 3.8.0软件的分析功能模块“Network analysis”进行网络拓扑属性分析,计算节点连接度(Degree)、中介中心性(BC)、接近中心性(CC)、局部平均连通性(LAC)、网络中心性(NC)5个重要拓扑参数,以每个参数都大于潜在靶点中位数作为筛选指标,筛选出核心靶点。

1.4.5 关键靶点基因的基因本体(GO)富集分析和基因相互作用京都基因和基因组百科全书(KEGG)富集分析 通过R语言和 Bioconductor平台(https:// www.bioconductor.org/)搜索复方治疗疾病的潜在基因靶点的基因ID,在R语言中安装“Colorspace”、“DOSE”、“Enrichplot”等依赖包,搜索汇总得到菝葜丹参复方治疗白癜风的主要生物学进程和代谢通路并进行富集分析,最后对数据进行可视化处理,分析相关基因生物过程及信号通路对白癜风的作用。

1.4.6 分子对接 通过PubChem(https://pubchem. ncbi.nlm. nih.gov)搜索并下载复方中药材主要活性成分的平面结构,通过Chem-3D软件得到活性化合物的3D结构,对此结构进行优化,作为小分子配体保存。从PDB(https://www. rcsb.org)数据库搜索下载疾病相关靶点的立体结构,利用Pymol清除水分子及其他配体分子,按照pdb格式保存备用。将蛋白分子及配体分子的pdb文件导入Pymol软件处理并转换为pdbqt格式文件,确定活性口袋。将处理好的小分子配体文件与靶蛋白大分子受体通过AutoDock Vina软件进行对接,计算结合能,并运用Pymol软件绘制对接图。

1.5 体外细胞实验研究

1.5.1 药液的提取制备 按照专利工艺以处方比例称取中药材粉末,加一定体积的含水乙醇,室温浸泡过夜,回流提取1.5 h,滤过,滤渣再次同法回流提取,合并两次的滤液,浓缩至浸膏,备用。阳性对照药选用8-MOP与消白酊药液,通过查阅文献及实验设计确定其最佳给药浓度[11]。

1.5.2 细胞的培养 取A375细胞接种于高糖DMEM完全培养基(含10%胎牛血清和1%双抗)中,37℃、5% CO2的条件下在培养箱中培养,次日换液。待细胞接近长满,用胰酶消化传代,继续培养。每次实验取自同一传代细胞,做进一步实验。

1.5.3 细胞增殖活性测定(MTT法) 取对数生长期A375细胞,弃上清液,用磷酸缓冲溶液(PBS)洗涤2次,用胰酶消化培养细胞,调整细胞密度,配成2.5×104个/mL的细胞悬液接种于96孔培养板,每孔加细胞悬液100 μL,细胞贴壁后加入不同浓度的药液200 μL/孔,(每个质量浓度设4孔,做3组),空白对照组加200 μL完全培养基,阳性对照药为甲氧沙林(8-MOP),在24、48、72 h后各孔加入5.0 g/L MTT溶液20 μL,培养4 h后再加入DMSO 150 μL,37℃孵育10 min,使紫色晶体完全溶解,490 nm处测定吸光度(OD)值。

1.5.4 黑色素含量测定 取对数期A375细胞按照细胞数量为1×105个/mL,接种到96孔板中,每孔2 mL,待细胞完全贴壁,弃去培养液,用PBS洗涤,加入10、50、100、250、500 μg/mL含药培养液,继续培养48 h后,弃培养液,用PBS洗涤2次,消化细胞,倒入离心管1 200 r/min离心5 min,弃去上清液,洗涤,加入含10%DMSO的1 mol/mL氢氧化钠溶液1 mL,60°C水浴加热1 h,加入96孔板,每孔100 μL,置酶标仪中测定490 nm处OD值,每个浓度设4个复孔,取平均值,实验重复3次。

1.5.5 酪氨酸酶活性测定 取对数生长期A375细胞,调整细胞浓度为5×104个/mL,培养板加入黑色素瘤A375细胞单细胞悬液每孔200 μL,待贴壁后加入含药物的培养液(阳性对照组为甲氧沙林和消白酊药液),分别继续培养48 h后弃培养液,用的磷酸缓冲溶液洗涤2次,每孔加入1%(体积分数)Triton X-100溶液90 μL,迅速置-80℃冻存1 h,随后室温融化使细胞完全裂解,37℃预温后加入10 g/L多巴溶液100 μL,37℃反应2 h,用酶标仪中测定475 nm处OD值。

1.5.6 处方比例调整与细胞增殖活性测定 按照网络药理学的结果,对处方中起主要作用的药材进行比例调整,按“1.5.3”项下的方法进行实验,验证网络药理学结果,确定复方君药,优化处方。

1.5.7 处方活性成分的筛选与验证 按照网络药理学及分子对接的结果,筛选出处方中的主要活性成分,探究成分对黑色素含量及酪氨酸酶活性的影响,将筛选出的木樨草素与芒柄花素成分配制成10 μmol/mL及50 μmol/mL浓度含药培养基给药,按“1.5.4”和“1.5.5”项下方法测定单体成分对酪氨酸酶活性及黑色素含量的影响。

2 结果

2.1 复方药材的主要活性成分通过TCMSP数据库收集复方药材中的主要化学成分信息。筛选去重后得到106个主要成分。经过Cytoscape3.8.0分析并按照degree值排序,取前20个活性成分。

2.2 复方药材对应靶点汇总结果通过TCMSP数据库对复方中中药材靶点进行收集,再利用uniport数据库对收集的蛋白名转换基因名,并弃去重复靶点,共得到药材相对应靶点为260个。

2.3 治疗白癜风的潜在作用靶点筛选通过GEO平台筛选出差异基因793个,并对lgFC>2的基因做热图,差异显著,通过热图筛选差异基因作为疾病相关靶点与TTD、OMIM、Drug bank等数据库的结合,共得到关于白癜风的靶点1 920个,与药材靶点映射交集得到治疗白癜风潜在靶点87个,见图1、2。

图1 白癜风差异基因热图

图2 潜在靶点venn图

2.4 活性成分-作用靶点网络的构建结果以87个潜在作用靶点及106活性成分建立菝葜丹参提取液治疗白癜风的“活性成分-作用靶点”网络,共有193个节点,表示所有成分与靶点数量,通过Cytoscape中CytoNCA程序以连接度为指标进行拓扑分析,筛选出排名前20的成分,见表1。511条边,表示成分-靶点相互作用关系,发现丹参(红)与鸡血藤(蓝)药材成分与白癜风疾病靶点连接数量最多,中间绿色方块儿为作用靶点,外围是药物成分,红色为丹参药材成分、蓝色为鸡血藤成分、紫色为菝葜成分、绿色为红花成分,见图3。

表1 菝葜丹参复方连接度排名前20成分

图3 药物活性成分-作用靶点网络

2.5 蛋白相互作用网络构建PPI网络中有87个蛋白节点,196条边,将 String平台获得的 TSV格式的PPI网络导入 Cytoscape软件进行拓扑分析,其中,共有21个活性成分的BC、CC、Degree值、LAC、NC值均大于平均值,提示这些成分可能是该复方治疗白癜风的主要活性成分,对21个基因再次进行筛选,选出对白癜风治疗作用最相关的核心基因,得到AKT1、ERS1、STAT3、RELA、TP53、MAPK1、MAPK14、MYC 8个核心基因,说明这8个蛋白靶点在菝葜丹参复方治疗白癜风疾病中发挥着重要的作用,是该复方治疗白癜风的核心靶点,见图4。

图4 PPI蛋白互作网络图

2.6 菝葜丹参复方治疗白癜风的GO功能富集分析GO功能富集分析显示,与生物过程(BP) 联系的条目有2 086条,主要涉及到活性氧代谢过程、氧化应激反应、T细胞活化、金属离子反应等; 与分子功能(MF) 联系的条目有139条,包括四吡咯结合、血红素结合、细胞因子受体结合、细胞因子活性信号受体激活剂、活性受体配体活性等; 与细胞组分(CC) 联系的条目有35 条,主要涉及到外膜、细胞器外膜、泡腔胞浆等,见图5。

2.7 菝葜丹参复方治疗白癜风的KEGG 通路富集分析KEGG富集结果有157条信号通路,主要包括AGE-RAGE相关通路、IL-17、TNF信号通路、Th-17细胞通路等免疫信号通路,都与白癜风的治疗相关,见图6。

2.8 分子对接经过CytoNCA拓扑分析及KEGG前20个通路靶点连接度,共同筛选出核心靶点为AKT1、ERS1、MAPK1、MAPK14、RELA、TP53、STAT3、MYC,此8个核心基因,经过文献查阅发现TYR对白癜风治疗中起至关重要的作用,所以在分子对接验证中加入了TYR基因,活性成分经过连接度排序选择前6个成分进行分子对接,其中结合紧密的靶点与成分见图7、8。

图5 GO富集分析

图6 KEGG信号通路富集分析

图7 分子对接热图

(注: A: AKT1与木樨草素; B: AKT1与槲皮素; C: RELA与丹参酮IIA; D: MYC与芒柄花素)

2.9 体外黑色素细胞实验结果

2.9.1 菝葜丹参搽剂对黑色素细胞增殖作用影响 8-MOP浓度为50 μmol/mL时对A375细胞增殖作用最强,因此选择该浓度的8-MOP作为阳性对照,见图9。菝葜丹参提取物浓度在10～100 μg/mL范围内对A375黑色素瘤细胞有一定的促增殖效果,给药浓度为50 μg/mL时对黑色素细胞增殖效果最强,且高于阳性对照组,见表2。

2.9.2 菝葜丹参搽剂对酪氨酸酶活性及黑色素含量的影响 菝葜丹参提取物浓度在10～100 μg/mL范围内对酪氨酸酶的活性有较显著的激活作用,同浓度下黑色素含量明显提高,且高于阳性对照组,见图10。

图9 阳性对照药给药浓度确定

表2 菝葜丹参搽剂对黑色素细胞的增殖作用

(注:与阴性对照组比较, *P<0.05)

2.9.3 不同处方比例的菝葜丹参搽剂提取液对黑色素细胞的增殖作用 随着丹参与鸡血藤比例增加,处方对黑色素细胞增殖的抑制作用明显增强,表明丹参与鸡血藤是该处方的君药,符合该处方的中医学组方原理,见图11。

2.9.4 单体成分对黑色素含量与酪氨酸酶活性的影响 木樨草素和芒柄花素对酪氨酸酶的活性有激活作用,能够提高黑色素的含量,见表3。

表3 单体对黑色素含量与酪氨酸酶活性的影响

(注: 1号为鸡血藤与丹参药材低比例处方, 2号为鸡血藤与丹参药材高比例处方)

3 讨论

白癜风是一种病因尚不明确的后天性色素脱失性皮肤疾病。中医学理论认为白癜风发病机制主要与气血瘀滞、风邪致病、肝肾不足等有关[12]。现代中药药理学实验显示,中药复方中的多种成分可通过作用于多个疾病相关靶点起到治疗疾病的作用。本研究结果发现复方菝葜丹参擦剂中106个化学成分可作用于白癜风相关的8个核心靶点,这些靶点涉及AGE-RAGE通路、Th17细胞分化、IL-17通路等多条信号通路,通过参与氧化应激反应、活性氧代谢反应、炎症免疫反应等多种途径,促进酪氨酸酶的活性和黑色素的形成。有研究表明[13]AGE-RAGE通路下游级联一部分CREB,通过激活MITF的cAMP反应元件共识基序,从而激活酪氨酸酶,促进黑色素细胞产生黑色素。Th17的分化可调节IL-17、IL-6、肿瘤坏死因子-α等炎症因子的分泌,在免疫炎症中起潜在作用,从而减少黑色素细胞损伤[14-15]。在体外药理学实验研究中,菝葜丹参提取液可提高酪氨酸酶的活性,促进黑色素细胞的增殖,提高黑色素的含量,此结果对复方菝葜丹参治疗白癜风的作用机制及功效的物质基础提供理论依据。网络药理学结果显示,复方菝葜丹参擦剂中丹参和鸡血藤两种药材的多数成分与白癜风疾病潜在靶点相关,有研究表明丹参[16]能够抑制CD-8T细胞募集,保护黑色素细胞不被破坏,且丹参中含有铜离子[17],能够激活酪氨酸酶活性,因此丹参与鸡血藤是该处方的君药。通过对处方中丹参和鸡血藤比例调整,体外药理实验结果显示,降低丹参与鸡血藤比例后处方对黑色素细胞增殖作用明显降低,比例增加则处方活性显著提高,表明丹参与鸡血藤是该处方中的君药成分,符合该处方的中医学组方原理。

通过CytoNCA拓扑分析筛选出配方功效相关的多个化学成分,发现丹参与鸡血藤中的多种化学成分与激活酪氨酸酶的活性相关,根据这一线索而开展的分子对接结果显示,以上两种药材所含的木樨草素和芒柄花素的关联性最显著。且有研究表明木樨草素[18]能够抑制受刺激的黑色素细胞释放白细胞介素8,从而抑制免疫细胞募集产生活性氧(ROS),而ROS对黑色素细胞有毒性作用。芒柄花素[20]通过激活酪氨酸酶活性的途径,从而提高黑色素含量[19]。本研究从复方药材中分离得到木樨草素和芒柄花素单体成分,通过体外药理实验验证,发现两种化学成分均能提高细胞中黑色素含量,其中木樨草素对酪氨酸酶具有较强的激活作用,对黑色素含量的提高效果尤为显著,提示该有效成分具有天然先导化合物潜力,可进行化学结构修饰研究和创新候选药物筛选。

综上所述,菝葜丹参复方对黑色素细胞具有一定的促增殖作用,通过激活酪氨酸酶,提高黑色素的形成和细胞内黑色素含量,其中有效成分木樨草素对酪氨酸酶激活作用较为显著。本研究印证了菝葜丹参复方是通过多种成分、多种途径作用到多靶点,最终对白癜风产生了治疗作用。