张利杰, 逯冉冉, 郝梦蝶, 杨新玲

(1新疆医科大学第二附属医院神经内科, 乌鲁木齐 830028; 2新疆医科大学, 乌鲁木齐 830017)

帕金森病(Parkinson′s disease,PD)是目前第二大常见的神经退行性疾病,主要危害老年人的运动功能从而导致生活质量下降[1]。研究证实PD患者在临床症状尚未出现之前就已伴随多巴胺(DA)能神经元的进行性丢失,所以早期诊断和治疗十分关键。目前PD的治疗主要以补充多巴胺改善患者运动障碍为主,但随着病情的进展疗效逐渐减退[2]。

随着对PD病理学研究的深入,提示铁死亡(Ferroptosis)参与DA能神经元的损伤过程[3-4]。铁死亡这一概念是在2012年被Devos等人提出,指一种铁依赖的脂质过氧化损伤,主要涉及铁代谢、脂质代谢及谷胱甘肽(Glutathione,GSH)代谢的失调[5]。研究提示,在PD患者临床治疗中,使用铁离子螯合剂去铁胺(Deferoxamine,DFO)干预后,能有效地缓解早期PD患者的运动障碍且具有较高的安全性[6],然而铁死亡抑制剂仅局限于针对缓解PD患者的早期临床症状,故其发病机制仍有待探究,以便更好的为临床治疗提供新方向。

Lon蛋白酶1(Lon Protease 1,LONP1)是一种存在于线粒体内的丝氨酸蛋白酶,通过降解线粒体中被氧化的蛋白质在氧化应激中起关键作用。LONP1表达上调时,能够加速降解线粒体内与活性氧(Reactive oxygen species,ROS)相关的蛋白,阻止脂质氧化损伤作用,对维护细胞线粒体功能和维持细胞内氧化还原平衡有重要影响。Wang等[7]的研究发现,LONP1能够通过调控脂质过氧化水平参与胰腺癌PANC1细胞铁死亡的损伤,提示LONP1在细胞铁死亡中可能存在重要作用。DA能神经元引起铁死亡的机制研究尚不清晰。目前尚未有对LONP1在PD细胞模型铁死亡中的作用进行报道,本研究通过6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导SH-SY5Y细胞构建PD细胞模型,采用质粒转染技术过表达Homo LONP1基因干预PD细胞模型,基于Keap1/Nrf2/GPX4信号通路探讨LONP1抑制脂质过氧化缓解DA能神经细胞铁死亡的可能机制,以期进一步寻求PD铁死亡的作用机制,为临床诊断提供新方向及新的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 材料人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)(武汉普诺赛生命科技有限公司);胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素/链霉素双抗溶液(美国Gibco公司);MEM/F12培养基、PBS缓冲液(武汉普诺赛生命科技有限公司);6-OHDA、Fer-1(铁死亡抑制剂)(MCE公司);Z-VAD-FMK(凋亡抑制剂)、Nec-1(坏死抑制剂)(Selleck公司);RIPA蛋白裂解液(北京索莱宝科技有限公司);BCA蛋白定量试剂盒(Biosharp公司);Homo LONP1基因过表达质粒和对照质粒空载体pEX-3(上海吉玛基因股份有限公司);LipofectamineTM3000转染试剂(美国 Invitrogen公司);丙二醛(MDA)检测试剂盒(碧云天生物有限公司);还原型谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司);LONP1、Nrf2、Keap1、GPX4及β-actin抗体(英国Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 SH-SY5Y细胞的培养 取冻存于液氮的SH-SY5Y细胞进行复苏及传代,在含有10%的胎牛血清、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的高糖MEM/F12培养液中培养,置于37℃、含体积分数为5%的CO2培养箱中培养,2～3 d换液一次。当细胞长至80%～90%时,0.25%胰蛋白酶进行消化,按1∶4进行传代或冻存。取对数生长期的细胞进行实验。

1.2.2 细胞增殖及毒性检测试剂盒(CCK-8)检测细胞存活率 取对数期生长的SH-SY5Y细胞,将细胞以3×104个/细胞种于96孔板,加入100 μL培养基进行培养。细胞贴壁完全且融合至80%时进行干预。不同浓度6-OHDA干预SH-SY5Y细胞存活率的测定:完全培养基培养细胞12 h后分别加入40、50、60、80、100、120 μM的6-OHDA(溶解在含有0.2%的维生素C生理盐水中)干预24 h,倒置荧光显微镜下观察细胞形态,最后每孔加入10 μL CCK8继续孵育4 h,酶标仪450 nm处读取吸光度计算细胞存活率,筛选适宜的造模浓度;不同抑制剂干预PD细胞模型存活率的测定:细胞分别暴露在含有1、5、10、20、30、40 μM的Fer-1,Nec-1和Z-VAD-FMK中12 h后加入80 μM的6-OHDA干预24 h,倒置荧光显微镜下观察细胞形态,最后每孔加入10 μL CCK-8继续孵育4 h,酶标仪450 nm处读取吸光度,根据细胞存活率筛选适宜的药物干预浓度。

1.2.3 细胞转染及倒置荧光显微镜下观察 取复苏后且已传三代的细胞接种于T25细胞瓶中,待细胞密度长至70%～80%时,使用LipofectamineTM3000转染试剂进行转染。首先配置转染试剂,A管中150 μL的Opti-MEM减血清培养基中加入8 μL的LipofectamineTM3000试剂,B管中150 μL的Opti-MEM减血清培养基加入3 μg的质粒制备DNA预混液后再加入5 μL的PM3000TM试剂,最后将A管和B管充分混匀室温放置15 min,将混合液加入细胞中进行转染,倒置荧光镜下观察细胞转染情况。

1.2.4 细胞分组 本研究分为正常对照组(NC组)、PD组、Fer-1+PD组、LONP1过表达+PD组及LONP1基因空载组。正常对照组:完全培养基培养36 h;PD组:完全培养基培养12 h后加入80 μM的6-OHDA干预24 h;Fer-1+PD组:10 μM的Fer-1预处理12 h后加入80 μM的6-OHDA干预24 h;LONP1过表达+PD组:Homo LONP1基因过表达质粒转染48 h,随后加入80 μM的6-OHDA干预24 h;LONP1基因空载组:对照质粒空载体pEX-3转染48 h,随后完全培养基培养24 h。

1.2.5 测定各组细胞内GSH含量 将SH-SY5Y细胞以2.5×105个/孔均匀接种于6孔板中,当细胞密度长至70%～80%时进行分组干预。收集各组干预后的细胞,PBS冲洗2次,1 000×g离心5 min收集沉淀细胞,加入0.3～0.5 mL等渗PBS缓冲液重悬细胞并研磨。取上清加入沉淀剂后3 500×g离心10 min,收集上清依次加入缓冲液和显色剂静置5 min。在酶标仪405 nm下测定吸光度,该实验重复3次,测定蛋白浓度,计算细胞还原型GSH含量。

1.2.6 测定各组细胞内MDA含量 将SH-SY5Y细胞以2.5×105个/孔均匀接种于6孔板中,当细胞密度长至70%～80%时进行分组干预。收集各组干预后的细胞,PBS冲洗后匀浆裂解,10 000×g离心10 min取上清,均在冰上进行操作。取0.1 mL的样品加入0.2 mL的MDA工作液混匀,100℃水浴加热15 min。水浴冷却至室温后1 000×g离心10 min,取200 μL上清至96孔板内,酶标仪532 nm处测定吸光度,该实验重复3次,测定蛋白含量,计算细胞MDA含量。

1.2.7 Western blot法检测各组细胞内LONP1、Nrf2、 Keap1及GPX4蛋白表达水平 收集以上5组细胞,去除培养液,PBS洗涤3次后加入RIPA裂解液,冰上裂解30 min,每隔10 min混匀一次,12 000×g离心15 min取上清,BCA法进行蛋白定量。加入等体积蛋白上样缓冲液,混匀后水浴锅100℃煮沸5 min,进行蛋白变性。按每孔30 μg等量上样,丙烯酰胺凝胶电泳后,转移至PVDF膜上,5%脱脂牛奶封闭2 h。TBST洗涤3次后加入一抗LONP1、Keap1、GPX4、β-actin(1∶5 000)及Nrf2(1∶1 000)4℃摇床过夜孵育。TBST洗涤3次后加入二抗(1∶5 000)室温孵育2 h。免疫印迹化学发光试剂(ECL)进行化学发光,凝胶成像系统中拍照。Image J软件采集PVDF条带上的灰度值,分析细胞内LONP1、Nrf2、Keap1和GPX4蛋白相对表达水平,实验重复3次。

2 结果

2.1 不同浓度6-OHDA干预SH-SY5Y细胞存活率情况及形态学变化6-OHDA干预的SH-SY5Y细胞存活率呈剂量依赖性下降,浓度过低不能诱导PD体外模型的建立,浓度过高造成细胞大量死亡无法进行后续实验,最终选择80 μM作为诱导PD体外模型的造模浓度(表1)。在倒置荧光显微镜下观察细胞形态,未经干预的SH-SY5Y细胞呈梭形或多边形,随着6-OHDA浓度的升高,细胞出现皱缩,胞体变圆,数量逐渐减少(图1)。采用CCK-8筛选适宜的抑制剂浓度,根据存活率筛选最佳的铁死亡抑制剂浓度,最终确定Fer-1最适浓度为10 μM(表2),Fer-1独立应用时可显著保护细胞免受6-OHDA的毒性作用。

表1 不同浓度6-OHDA干预SH-SY5Y细胞的存活率

0 μM(40倍镜)

40μM (40倍镜)

50μM(40倍镜)

60μM (40倍镜)

80 μM(40倍镜)

100μM (40倍镜)

120μM(40倍镜)

表2 各抑制剂干预PD细胞模型的存活率

2.2 质粒转染情况结果显示,在转染后第48小时,质粒在倒置荧光显微镜下高表达绿色荧光蛋白(GFP),荧光随细胞呈现出神经元形态,提示本研究运用的转染方法及质粒载体具有较高的转染效率(图2)。

(40倍镜)

(100倍镜)

2.3 各组细胞内MDA和GSH含量的变化与NC组比较,PD组MDA含量上升,GSH含量下降(P<0.05);与PD组比较,Fer-1+PD组和LONP1过表达+PD组MDA含量均下降,GSH含量均上升(P<0.05),见表3。

表3 各组PD细胞内GSH和MDA的含量变化

2.4 各组细胞内LONP1、Nrf2、Keap1和GPX4蛋白的表达与NC组比较,PD组Keap1蛋白表达上升,Nrf2和GPX4蛋白表达下降,差异具有统计学意义(P<0.05);与PD组比较,Fer-1+PD组和LONP1过表达+PD组的Keap1蛋白表达水平均下降,Nrf2和GPX4蛋白表达均上升,差异具有统计学意义(P<0.05);与LONP1基因空载组比较,LONP1过表达+PD组LONP1蛋白表达上升(P<0.05),质粒转染成功且高表达,见图3、表4。

图3 各组细胞内LONP1、Nrf2、Keap1和GPX4蛋白的表达

表4 各组细胞内LONP1、Nrf2、Keap1和GPX4蛋白表达比较

3 讨论

本研究采用LONP1过表达质粒转染SH-SY5Y细胞,结果证实LONP1过表达后通过升高GSH含量,降低MDA水平,阻止脂质过氧化物加重细胞的损伤,同时升高Nrf2和GPX4蛋白的表达,提高抗氧化水平,阻止铁依赖的脂质过氧化的发生,保护DA能神经元细胞免受铁死亡的损伤。

铁死亡主要表现为在铁离子的累积下,通过芬顿反应发生铁依赖的脂质过氧化,脂质活性氧的过度积累和抗氧化体系失调,引起的细胞氧化应激反应,使蛋白质、核酸和脂质发生不可修复的损伤,最终导致细胞发生铁死亡[8]。本研究中发现6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞建立的PD细胞模型中GSH含量下降,不能及时地将具有潜在毒性的过氧化脂类还原成无毒的脂醇,诱导胞内氧化反应的发生。同时,脂质代谢失调还能引起脂质过氧化物含量的增加,在二价铁和酯氧合酶的作用下氧化细胞膜上高表达的不饱和脂肪酸并分解成活性物质,募集相关分子诱导铁死亡的发生[9-10]。Lei等[11]研究报道,PD患者大脑黑质部具有铁沉积多、脂质过氧化及还原型GSH低的特点。

本研究结果显示在该PD细胞模型中Keap1蛋白表达上升、Nrf2和GPX4蛋白表达下降。Nrf2是细胞内抗氧化调控的重要转录因子,在介导铁代谢、脂质代谢和GSH合成方面发挥重要作用,而以上均涉及铁死亡的发生[12]。在氧化应激刺激下,Nrf2从Keap1上解离移入细胞核,与下游的抗氧化反应原件结合,激活SOD、GPX4等抗氧化蛋白的转录,增加细胞抗氧化能力[13-14]。在铁死亡中,Nrf2和GPX4的含量降低导致活性氧(ROS)堆积,铁离子与过氧化氢结合诱导芬顿反应,导致DA被铁氧化形成多巴胺醌进入细胞毒性途径,与细胞内蛋白质氨基酸的残基结合,对其造成损伤,诱导DA能神经元铁死亡[15]。这一结果在PD体内实验中曾被证实,PD模型鼠黑质致密部存在大量的脂质过氧化物堆积,在过表达Nrf2的PD模型鼠中,铁离子聚集较少,ROS的生成和氧化应激水平显著下降[16-17]。

LONP1在线粒体内具有多面性,主要参与线粒体代谢和自由基损伤反应,控制蛋白质质量和维护线粒体功能等。LONP1的下调参与了神经退行性疾病的发生与发展,LONP1的表达降低使得异常折叠的蛋白质降解受阻出现堆积,导致线粒体功能紊乱,结构丧失,诱发细胞凋亡。在早发性染色体隐性帕金森病中,编码PTEN诱导激酶1(PTEN-induced kinase 1,PINK1)的PARK6基因发生突变;LONP1表达降低使得PINK1在线粒体基质中大量堆积,继而诱发线粒体自噬,导致PD的发生[18]。在心肌梗死发病过程中,组织缺血缺氧,LONP1表达增加后诱导活性氧升高,最终线粒体功能障碍诱导了心肌细胞的凋亡,与Shin等[19]的研究结果不一致。在2型糖尿病中,LONP1的下调导致胰岛素信号传导受损、葡萄糖异生酶水平升高,加重疾病的进展[20]。本研究通过质粒转染LONP1基因干预PD细胞模型后,结果显示GSH含量上升,加速细胞内脂质过氧化物的还原,减少了脂质过氧化对细胞膜及脂类物质的氧化作用;同时,LONP1通过降低Keap1蛋白表达,促使大量的Nrf2转入细胞核内,激活下游抗氧化蛋白的转录,减少铁依赖的脂质过氧化的发生,阻止铁死亡的发生。

综上所述,本研究结果提示,LONP1通过调控Nrf2、Keap1和GPX4蛋白表达水平抑制铁死亡,改善氧化应激水平,发挥神经保护作用。该结果已在PD体外模型得以证实,但还未在PD临床和动物实验中进行验证,其确切的变化仍需在临床中证实,这一实验结果可为临床提供新的诊断方向及为临床新药开发提供新思路。