钟 烁, 苗 伟

(开滦总医院耳鼻喉科, 河北 唐山 063000)

慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉(CRSwNP)是由于多种因素造成的鼻黏膜炎症病变,一般发生在鼻黏膜以及副鼻窦区域[1]。CRSwNP是耳鼻喉科常见的疾病,患者表现出流涕、鼻塞、疼痛等症状,严重者会出现嗅觉障碍,病程一般超过12周,在我国的发病率为8%～15%[2]。临床研究显示,年龄越大其患病风险越高,一般发病集中于35～59岁人群[3]。糖皮质激素是有效的抗炎和免疫抑制剂,是治疗CRSwNP的一线药物[4]。临床上常采用短期口服泼尼松龙等糖皮质激素治疗CRSwNP,但部分患者表现出糖皮质激素抵抗,导致治疗效果不佳。黏蛋白5AC(MUC5AC)是气道上皮细胞中表达的一种黏蛋白,CRSwNP患者呼吸道发生炎症反应后会引起MUC5AC大量分泌[5]。诱导缺氧因子-1α(HIF-1α)是炎症反应所刺激的信号通路中重要的转录因子之一,可以促进MUC5AC分泌[6]。Yu等[7]研究显示,HIF-1α与CRSwNP患者的气道炎症和糖皮质激素抵抗有关。本文对关于CRSwNP患者鼻黏膜组织HIF-1α、MUC5AC表达与糖皮质激素抵抗关系进行探究,以期为临床预测CRSwNP糖皮质激素抵抗,以及时调整治疗策略获得更好的临床效果。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取开滦总医院耳鼻喉科2017年8月至2022年6月接诊的160例慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉患者为研究对象,其中男性88例,女性72例;年龄30～53岁,平均(39.19±6.16)岁。诊断标准:(1)符合《慢性鼻-鼻窦炎诊断和治疗指南(2012昆明)》[8]中慢性鼻-鼻窦炎临床症状诊断标准:鼻塞,有黏性或黏脓性鼻涕,自觉头面部胀痛,嗅觉减退或丧失;(2)鼻窦CT显示鼻窦黏膜或窦口鼻道复合体有炎性病变;(3)鼻内镜检查有鼻息肉,且可观察到鼻黏膜充血、中鼻道和嗅裂有黏脓性分泌物。纳入标准:(1)发生上述临床症状时间≥12周;(2)入院前1个月未接受过激素、抗生素或其他治疗鼻炎的药物治疗;(3)患者及家属知情同意。排除标准:(1)合并萎缩性鼻炎;(2)合并支气管扩张、上呼吸道慢性炎症等;(3)依从性较差者。本研究已通过医院伦理委员会批准。

1.2 治疗与分组治疗方案:给予160例患者口服泼尼松龙(醋酸泼尼松龙片,5 mg×100片/瓶,国药准字H31020771,天津信谊津津药业有限公司),0.5 mg·kg-1·d-1连续服用14 d。分组依据:治疗前、治疗后分别参照鼻息肉内镜评分系统进行评分[9],分别从3个维度进行评价:(1)鼻息肉:无息肉记0分,息肉仅存在于中鼻道记1分,息肉存在范围超过中鼻道记2分;(2)分泌物:无分泌物记0分,分泌物稀薄记1分,分泌物黏稠记2分;(3)黏膜水肿:无水肿记0分,轻度水肿记1分,严重水肿记2分;以上3个维度得分相加即为总分。与治疗前相比,治疗后评分下降≥1分的患者为正常组,评分下降<1分的为抵抗组。

1.3 检测指标口服激素治疗前,取所有患者适量鼻黏膜组织,分为两部分。(1)取一部分鼻黏膜组织进行免疫组化观察HIF-1α、MUC5AC的表达位置:将鼻黏膜组织用4%多聚甲醛固定,进行常规石蜡包埋并切片,将切片脱蜡脱水处理,用冰冷的PBS缓冲液洗3次,在柠檬酸盐缓冲液中浸泡5 min,95℃水浴锅中温育20 min,在3%过氧化氢溶液中浸泡10 min,与适量HIF-1α、MUC5AC一抗(1∶500稀释,美国Abcam公司)在4℃下孵育一晚,PBS缓冲液冲洗2次,加适量辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶500稀释,美国Abcam公司)在37℃下孵育30 min,PBS缓冲液冲洗2次,用DAB进行显色处理(3～15 min),PBS缓冲液冲洗2次,用苏木素复染,进行常规脱水、透明,中性树脂封片后,在光镜下观察染色情况,400倍视野下可见阳性细胞在显微镜下呈棕褐色。(2)取另一部分鼻黏膜组织进行RT-PCR检测其中HIF-1α、MUC5AC的表达:将鼻黏膜组织制备成组织匀浆液,用Trizol法(上海翌圣生物科技有限公司)提取mRNA,提取后采用采用Qubit4.0核酸定量仪荧光计(美国赛默飞世尔科技有限公司)检测提取出的mRNA浓度,用一步法RT-qPCR试剂盒(上海翌圣生物科技有限公司)先进行逆转录,再以互补脱氧核糖核酸(complementary Deoxyribonucleic acid,cDNA)为模板进行qRT-PCR扩增,引物序列见表1。反应条件如下:42℃ 30 min(1×),94℃ 5 min(1×),95℃ 15 s+60℃ 1 min(35×)。以β-actin为内参基因,采用2-(△△Ct)计算目的基因的相对表达量。

表1 目标基因引物序列

2 结果

2.1 两组患者的临床基线资料比较经比较,正常组和抵抗组患者的性别、年龄、病程、吸烟史和家族史等临床基线资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。治疗前鼻内镜下可见鼻黏膜水肿、鼻咽部白色泡沫状分泌物(图1A、1B);治疗后鼻内镜下可见鼻腔症状明显改善,鼻咽部基本无分泌物(图1C、1D)。

表2 两组慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉患者的临床基线资料的比较

(注:A、B:治疗前鼻黏膜水肿、鼻咽部白色泡沫状分泌物;C、D:治疗后鼻腔症状明显改善,鼻咽部基本无分泌物)

2.2 鼻黏膜组织免疫组化和RT-PCR结果抵抗组患者鼻黏膜组织中HIF-1α和MUC5AC mRNA的表达高于正常组(P<0.05),见表3。经免疫组化染色,可见HIF-1α主要在细胞核中表达,在细胞质中部分表达,抵抗组表达水平高于正常组;MUC5AC主要在细胞质内表达,抵抗组表达水平高于正常组。见图2。

表3 两组患者鼻黏膜组织中HIF-1α与MUC5AC mRNA水平的比较

(注:A:HIF-1α在正常组患者鼻黏膜组织上的表达;B:HIF-1α在正常组患者鼻黏膜组织上的表达;C:MUC5AC在抵抗组患者鼻黏膜组织上的表达;D:MUC5AC在抵抗组患者鼻黏膜组织上的表达)

2.3 HIF-1α与MUC5AC mRNA表达之间的相关性经Pearson相关性分析,患者鼻黏膜组织中HIF-1α与MUC5AC mRNA表达之间呈正相关(r=0.582,P<0.05)。见图3。

2.4 慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉患者糖皮质激素抵抗的Logistic回归分析以性别、年龄、病程、吸烟史、家族史及HIF-1α、MUC5AC mRNA表达水平为自变量,糖皮质激素抵抗情况为因变量(正常=0,抵抗=1),进行单因素和多因素Logistic回归分析,结果显示,HIF-1α与MUC5AC mRNA表达水平为影响糖皮质激素抵抗发生的独立危险因素(OR=3.268、3.057,P<0.05)。见表4。

图3 HIF-1α与MUC5AC mRNA表达的相关性

表4 慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉患者糖皮质激素抵抗的单因素和多因素Logistic回归分析

2.5ROC曲线分析对HIF-1α与MUC5AC mRNA表达水平进行ROC曲线分析,结果显示,以HIF-1αmRNA表达水平≥0.549为预测糖皮质激素抵抗的分割点,曲线下最大面积为0.804,灵敏度为68.70%,特异度为86.21%。以MUC5AC mRNA表达水平≥0.543作为预测糖皮质激素抵抗的分割点,曲线下最大面积为0.706,灵敏度为76.34%,特异度为75.86%。见图4。

图4 HIF-1α与MUC5AC mRNA水平预测糖皮质激素抵抗的ROC曲线

3 讨论

临床研究发现,慢性阻塞性肺炎、哮喘、变应性鼻炎等慢性气道炎症疾病患者在接受糖皮质激素治疗后均有可能出现抵抗现象[10-11]。因此及时有效地发现糖皮质激素抵抗对尽早改变治疗方案、控制疾病发展具有重要意义。但目前为止,尚未发现有效的可以预测CRSwNP患者糖皮质激素抵抗发生的生物指标。

MUC5AC是一种呼吸道黏蛋白,CRSwNP患者的鼻粘液中含有大量的MUC5AC[12]。HIF-1α是HIF-1的亚型之一,在机体炎症反应的发生过程中具有重要作用,可促进MUC5AC分泌,引发气道中脓性分泌物的聚集[13]。既往研究显示,CRSwNP患者鼻息肉组织中HIF-1α mRNA表达升高,其表达量不仅与中性粒细胞的数量呈正相关,而且与患者糖皮质激素抵抗有关[7]。本研究结果显示,抵抗组患者鼻黏膜组织中HIF-1α和MUC5AC mRNA的表达高于正常组,提示糖皮质抵抗患者鼻黏膜中HIF-1α和MUC5AC表达升高。

目前CRSwNP的发病机制尚不明确,但是有研究显示其发病原因可能与Th2细胞因子的表达增加密切相关。糖皮质激素由于其抗炎和免疫调节功能而被用于治疗一系列鼻部炎症疾病,如CRSwNP、变应性肺炎等,其主要通过与糖皮质激素受体α结合,促进抗炎基因表达来发挥抗炎作用。研究显示糖皮质激素受体异常、激素活性酶异常、中性粒细胞增多等因素均可能导致糖皮质激素抵抗[14]。气道和鼻窦中粘液分泌过多是CRSwNP的主要临床特征,MUC5AC又是粘液中主要的大分子成分,其分泌受到HIF-1α的调节[15]。HIF-1α由巨噬细胞、中性粒细胞、树突细胞和淋巴细胞表达,是缺氧反应的核心成分。HIF-1α可以通过调节下游因子的表达,增加血管通透性和组织水肿,促进上皮细胞向间充质细胞的转化,在鼻息肉的发病机制中发挥作用[16]。

本研究经Pearson相关性分析发现,患者鼻黏膜组织中HIF-1α与MUC5AC mRNA表达之间呈正相关,经多因素Logistic回归分析发现,HIF-1α高表达、MUC5AC高表达是糖皮质激素抵抗发生的独立危险因素。Xu等[17]研究显示,支气管气道中MUC5AC的分泌与HIF-1α有关,与本研究结果一致。本研究进一步行ROC曲线分析,结果显示以HIF-1αmRNA表达水平≥0.549和MUC5AC mRNA表达水平≥0.543作为预测糖皮质激素抵抗的分界点具有较高的灵敏度和特异度,提示HIF-1α和MUC5AC的表达可以作为预测CRSwNP患者糖皮质激素治疗发生抵抗的重要指标。史志芳等[18]研究显示,MUC5AC在CRSwNP患者中呈高表达,并且对CRSwNP具有一定的诊断价值,与本研究结果相似,说明HIF-1α和MUC5AC的表达可以作为预测CRSwNP患者糖皮质激素治疗发生抵抗的指标。

综上所述,慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉患者鼻黏膜组织中HIF-1α与MUC5AC的表达呈正相关,可以作为预测糖皮质激素治疗慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉患者临床疗效的指标。但本研究并未对其详细机制进行探究,因此将在下一步研究中,对HIF-1α与MUC5AC的表达对糖皮质激素抵抗的详细机制与影响进行系统的探究。