张家源 张红兵 李海宁 郭帆

(1.河北经贸大学生物科学与工程学院，河北 石家庄 050061；2.华电水务科技股份有限公司，河北 石家庄 050061)

引言

微藻在自然界中通常是光能自养型的真核微生物，即通过光合作用将CO2转化为自身的有机组成成分[1]；也可以进行异养培养，即在无光条件下通过呼吸或发酵途径利用有机碳源；另外，还能进行混合营养培养，可同时利用CO2和有机碳，通过呼吸和光合作用生长，产生生物物质或代谢物。显然光能自养培养方式更加经济环保，异养培养摆脱了对光的依赖性需求，而混合培养兼具异养和自养的优势，利用有机或无机物质(可以是废弃物)的同时可以大幅提高微藻生物质的产量和质量。因此微藻的混合营养培养具有降低藻类生物质生产成本的可能性。

作为代表性的微藻，小球藻及其相关衍生产品在环境保护[2，3]、清洁能源[4-6]、医疗卫生[7]和营养食品[8，9]等行业具有重要的应用价值，一直是研究热点。目前实验室中多采用光能自养培养，生长相对缓慢，收获量偏低，导致实验周期长，成本居高不下，如果能够通过合适的培养条件优化，就可以在缩短小球藻生长周期的同时提高产量，问题将迎刃而解。然而，以往研究多针对某种微藻进行条件优化[10，11]，所得到的结果普适性不足，培养成本较高，因此需要探索一种优异的、简便廉价的培养方式。

本文以小球藻为例，使用廉价碳源糖蜜与蛋白胨，结合响应面法探究微藻混养模式条件，以取代原有光能自养模式，确定较好的培养条件，进一步探索该条件对于其他藻类生长的影响，为相关研究和生产提供参考。

1 实验方法

1.1 培养方法

将小球藻(分离纯化于华电水务科技股份有限公司，保藏于本实验室)用BG11培养基(青岛海博生物技术有限公司)活化后接种于各液体培养基中，初始接种量均为10%，在27℃、光照强度4000lx全光照培养，每日手摇4次，用光密度值(OD680nm)监控小球藻生长状况。

1.2 单因素实验

以BG11为基础培养基进行自养培养；以糖蜜10g·L-1、蛋白胨5g·L-1、自然pH为基础，加富培养基进行混养培养，单因素实验选择糖蜜为额外碳源，额外蛋白胨为氮源，培养至7d，观察糖蜜、蛋白胨、光照强度3个基本变量因素水平强度与小球藻生长的关系，见表1。

表1 小球藻培养的单因素及其水平

1.3 响应面分析

以单因素实验结果为基础，使用Design-expert 8设计响应面实验，考察的因素实际值与编码值如表2所示，每组设3个平行实验，取平均值进行响应面分析并确定优化培养基与培养条件。

表2 响应面分析考察的因素实际值与编码值

1.4 常见培养基对小球藻生物量的影响

常见市售培养基(牛肉膏蛋白胨培养基、高氏1号液体培养基、马铃薯蔗糖液体培养基、LB肉汤培养基)以及1.3中得到的优化培养基，按1.1的方法培养小球藻，每隔24h的OD680数值绘制生长曲线。

1.5 优化培养基对不同藻种的影响

为对比不同微藻在优化的培养基中生长状况，取对数期中后期的小球藻WS1001、小球藻WS1006、栅藻WS1008、栅藻WS1009(均由本实验室分离纯化保存)接种于BG11培养基与优化培养基，培养方法按1.1进行，吸光度测定并对比4株微藻自养、混养条件下的生长速率。

1.6 数据统计分析

每个实验处理组均平行重复3次。本研究中实验数据均采用SPSS 26.0软件进行显著性分析，差异显著水平为P<0.05。

2 结果与讨论

2.1 混养单因素对小球藻生长的影响

如图1a所示，在混养情况下，糖蜜对小球藻生长速率具有显著的促进作用(P<0.05)，在糖蜜添加量为10g·L-1、20g·L-1、30g·L-1时，与未加糖蜜相比，小球藻的生物量显著增加(P<0.05)；如果糖蜜浓度继续增加，微藻生长反而变慢，推测可能高浓度的糖蜜导致培养基中渗透压升高，反而不利于小球藻的生长，与苏杰龙等[12]研究一致。蛋白胨对微藻生长也有促进作用，且剂量效应很明显，如图2b所示；当蛋白胨浓度为5g·L-1时，与空白组相比较生物量显著增加(P<0.05)，当浓度提高到15g·L-1效果最为明显，当浓度高于15g·L-1以后效应逐渐变差，可能是过高的氮浓度反而抑制微藻的生长；Gutierrez等[13]也发现，在许多光自养型微生物中，高浓度的氮会破坏其光合作用系统，不仅导致其生长速率放缓，严重时可导致微生物死亡。至于光照强度，由于小球藻含有叶绿素，属于具有光合作用的微生物，如图1c所示，当没有光照时，小球藻培养7d后的吸光度远低于图1a、图1b中有光源时的数值，说明小球藻作为光自养微生物，光照是藻类生长的关键条件之一[14]，对藻类生物量的积累和生命活动影响巨大。即使碳源与氮源充足，缺乏光照仍然使小球藻的生长受到限制。图1c结果表明，当光照强度提高到4000lx后，小球藻的生物量迅速提高，并在8000lx时达到峰值，说明8000lx左右的光照强度为最适光照强度。

图1 糖蜜、蛋白胨和光照强度对小球藻生长的影响

2.2 响应面优化实验

根据单因素实验结果，使用Design expert 8中的Box-Behnken方法设计了17组实验，结果如表3所示。

表3 响应面实验设计及结果

使用Design expert 8对获得的数据进行多元回归拟合，所得到的回归模型方程：

Y=6.45+0.081A+0.12B+0.34C-0.23AB-0.076AC

+0.19BC-0.17A2-0.36B2-0.27C2

由表4中回归方差分析显著性检验表明，校正系数R2=0.8460，RAdj=0.6480；并且该回归模型显著(P<0.05)，失拟项(P<0.2645)不显著，说明模型合理且与实际实验拟合度较高，并且模型预测值与实验实测值具有较好的相关性，可以用于小球藻混和培养条件的分析和预测。

根据回归方程和后续的方差分析可知，一次项C的差异显著(P<0.01)，但B(P=0.2449)、A(P=0.4017)差异不显著，各因素的显著性排序为C>B>A。

为了分析各因素对于小球藻生长的影响，采用三维(3D)响应面和二维(2D)等高线图表示回归方程，观察响应值与每个测试变量之间的关系，确定任意2个变量之间的相互作用，发现因变量的最大预测值位于三维响应面峰值或等值线图中的最小椭圆上[15]。

表4 方差分析结果

图2 培养条件交互作用对吸光度的影响

通过Design expert 8中的回归模型预测得到，小球藻最佳培养条件为糖蜜17.40g·L-1，蛋白胨17.32g·L-1，光照强度11295.45lx；并考虑到实验操作的可行性及减少相关能源的消耗，将回归模型预测的理论值修整为糖蜜17g·L-1，蛋白胨17g·L-1，光照强度11000lx；在此培养条件下进行3次重复实验，得到小球藻的生物量为6.32；与预测值6.60差异较小，表明响应面法生长条件优化结果是可靠的。

糖蜜和蛋白胨添加量的交互作用对吸光度的影响如图2a、图2b所示，AB交互曲面中吸光度随着糖蜜的增加呈现先增加后降低的趋势，其中当糖蜜添加量为20g·L-1、蛋白胨添加量为15g·L-1时，吸光度达到最大值6.3；等高线图中糖蜜的等高线变化陡峭程度大于蛋白胨，结合方差分析，说明糖蜜对吸光度的影响大于蛋白胨。

图2c、图2d为光照强度和糖蜜的交互对于吸光度的影响，当糖蜜添加量为20g·L-1，光照强度为8000lx时，吸光度达到最大值7.33；等高线图中光照强度的等高线较之糖蜜陡峭，同时结合方差分析，说明光照强度对吸光度的影响大于糖蜜。并且AC等高线图呈椭圆形，说明糖蜜与光照强度的交互作用不明显。

图2e、图2f为蛋白胨(B)和光照强度(C)的交互对吸光度的影响，在蛋白胨添加量为15g·L-1、光照强度为8000lx时，吸光度达到最大值6.3，结合方差分析，证明其相互间不具有显著的交互作用。

2.3 不同培养基对小球藻生物量的影响

由图3可知，LB肉汤和牛肉膏蛋白胨培养基虽然氮源均较丰富，但对应的生物量却有显著性差异，推测是NaCl浓度的差异导致，因为过高浓度的NaCl会抑制小球藻的生长，Li等[16]研究也证实，在BG11培养基中添加10～15g NaCl对绿藻的生长没有显著影响，而当NaCl浓度超过20g·L-1时有显著抑制作用。

微藻在以蔗糖或淀粉为主要碳源时，其生长速率要远低于以葡萄糖为主要碳源，甚至有些微藻完全不能利用蔗糖或淀粉，糖蜜中含有一部分葡萄糖可供微藻生长利用。本试验中小球藻在高氏1号培养基中生长缓慢，培养至7d时的吸光度值仅为0.509，说明小球藻利用淀粉的能力非常有限；但在马铃薯蔗糖液体培养基中生物量有显著提高，培养7d后的吸光度达到3.7左右。推测微藻的淀粉酶活性较弱，难以利用淀粉。

图3 不同培养基对小球藻生物量的影响

2.4 优化微藻培养基对不同微藻的影响

4株不同微藻接种于优化培养基后的吸光度如图4所示。结果表明，与BG11培养基比较，4株微藻在优化培养基及培养条件中生长速率、生物量均有显著性提高。2株小球藻在接种后迅速进入对数期，栅藻的生长速率虽然在前3d时与自养条件相差不大，但生物量在4d后迅速增加，说明优化后培养条件可以不同的幅度明显提升不同种微藻生长速率，对微藻的生长具有普适性。

图4 优化微藻培养基对不同藻的影响

3 结论

本研究通过添加碳源与氮源，测定比较混合营养条件与光能自养条件下小球藻的生长速率与生物量；进一步使用响应面法优化混养培养条件的变化对小球藻生长的影响，最终培养条件优化为糖蜜17g·L-1、蛋白胨17g·L-1、光照强度11000lx；在此条件下小球藻吸光度值为6.32，与理论值差异可接受。综合表明，优化后的混合营养条件可以显著提高微藻的生长速率及生物量，节约育种时间，使用试剂廉价，操作简便易行。