谭英剑 陈志明 莫 然 黄 昕 杨 勇

中国医学科学院、北京协和医学院皮肤病医院遗传病中心、江苏省皮肤病与性病学重点实验室,江苏南京,210042

Waardenburg综合征(Waardenburg syndrome, WS)是一种具有较强遗传和临床异质性的综合征疾病,以皮肤、毛发等色素异常,虹膜异色和先天性感音神经性耳聋为主要临床特征。1951年,荷兰眼科医师Waardenburg首次报道该病并正式命名为Waardenburg综合征[1]。目前已发现WS的主要致病基因有MITF、PAX3、SOX10、EDN3、EDNRB和SNAI2[2]。WS可分为4型,I型WS的特征性表现为内眦外移,II型WS与WS1型类似但不伴有内眦外移,3型WS为在WS1型基础上合并肌肉、骨骼系统畸形,4型WS常伴有先天性巨结肠等肠道病变。WS患者主要因先天性耳聋就诊于耳鼻喉科,皮肤科医师对此病的认识较少。本研究对一例WS患儿进行了外显子组测序分析,为明确WS诊断提供了分子遗传学证据,有利于患者及早进行听力检查、遗传咨询、产前诊断等。

1 资料与方法

1.1 临床资料 先证者,男,10岁。因面部皮疹7年于2022年8月就诊于我院。患儿3岁起出现弥漫分布的雀斑样褐色色素沉着,间杂色素脱失斑点,边界清楚,无隆起,随年龄增长逐渐增多,上肢和臀部也散在色素沉着斑。年幼时头发色素减退,颜色偏黄,后逐渐呈棕黄色。出生时双眼虹膜色素减退,呈天蓝色,后期颜色无明显变化,眼距正常(图1)。出生时听力障碍,2岁行人工耳蜗植入。无生长发育障碍。患儿父母和2个姐姐均正常,父母否认近亲结婚。

图1 Waardenburg综合征先证者主要临床表现 1a:面部褐色色素沉着伴色素脱失斑;1b:眼虹膜呈天蓝色;1c:上肢散在色素沉着斑 图2 Waardenburg综合征患者家系及Sanger测序图 2a:家系图;2b:先证者MITF基因7号外显子存在一杂合突变c.649_651delAGA,其父母未检出突变

体格检查:一般情况良好,身高146 cm,体重32 kg,体质指数15.0,智力和体格发育无明显异常。听力检查:佩戴人工耳蜗,听力正常。皮肤科检查:面部弥漫分布黄豆大褐色色素沉着斑,间杂色素脱失斑点,上肢和臀部散在分布类似褐色斑点。头发色素减退,呈棕黄色。眼科检查:双眼虹膜色素减退,呈天蓝色,眼距和视力正常。

1.2 方法

1.2.1 遗传性皮肤病目标基因外显子组测序 本研究经中国医学科学院皮肤病医院医学伦理委员会批准[(2019)临审第(005)号],选取先证者及其父母作为基因突变检测对象,三人均签署知情同意书后,抽取外周血各2 mL置于真空EDTA抗凝管内,提取基因组DNA,送至北京迈基诺基因科技股份有限公司行遗传性皮肤病目标基因外显子组测序,目标区域长度为2.46 Mb,含已知致病基因726个。数据下机后,从该患者DNA中总共检测出5188个SNP变异位点,对其进行分析筛选:第一步筛选位于外显子区或剪切区的位点,得到1545个位点;第二步选择最高人群频率≤0.05的位点,得到127个位点;第三步过滤掉质控数据较差的突变,剩余101个位点;第四步筛除Clinvar数据库中已知的良性位点,剩下可能致病的或不确定的位点,同时选择Disease Information中存在对应疾病的位点,剩余38个位点;第五步筛选突变频率≥0.2,测序深度≥20的位点,得到32个位点;最后选择其中符合临床表型的致病基因,进行下一步分析。

1.2.2 Sanger测序 根据检测得到的可疑致病突变位点,对先证者及其父母MITF基因第7号外显子及其侧翼序列进行PCR扩增。正向引物“CCGTTGTCATGACCTGGAG”,反向引物“GTTTCAGAAAGCCACCTCCTC”。PCR 反应条件:98℃预变性2 min;98℃变性10 s,64℃退火30 s,72℃延伸10 s,10个循环;98℃变性10 s,55℃退火30 s,72℃延伸10 s,25个循环;72℃延伸5 min。对扩增结果进行Sanger测序,并用Snapgene软件将其与MITF基因参考序列进行比对。

2 结果

遗传性皮肤病目标基因外显子组测序结果显示,先证者MITF基因第7号外显子第649～651位核苷酸发生杂合性缺失突变(NM_000248,exon7,c.649_651delAGA),导致其编码的第217位精氨酸缺失(p.R217del)。先证者父母均未检出该突变,提示该突变为新发突变(图2)。该突变位点已有多例报道,已明确能够导致WS[3,4]。该突变为非重复序列区域框内缺失,在正常人中频率较低,突变与疾病表型符合共分离。根据ACMG指南,可判断该突变是导致该患者出现WS的致病性突变[5]。

3 讨论

随着测序技术的进步,WS的发病机制逐渐被揭示。目前关于WS发病机制的学说较多,而较为公认的假说为胚胎时期神经嵴的分化异常。在神经嵴细胞迁移的过程中,其可分化成为外胚层和非外胚层两部分。外胚层间质衍生为骨、软骨等组织,而非外胚层间质可衍生为神经元、神经胶质细胞和黑色素细胞等[6,7]。调控神经嵴细胞发育或黑色素细胞形成、分化等过程的基因突变或表达异常,可引起皮肤、毛发等的色素改变及其他骨骼、肌肉等的异常。黑素细胞向皮肤迁移和分化过程发生异常,引起表皮基底层和毛囊黑素小体生成的黑色素减少,导致皮肤色素减退。当黑素细胞从神经嵴向耳蜗血管纹迁移与分化过程中出现异常,会导致黑素细胞来源的中间细胞减少、毛细胞缺失和耳蜗结构缺陷,影响内耳结构发育从而导致感音神经性耳聋。

WS具有遗传异质性和临床异质性,已明确的致病基因包括MITF、PAX3、SOX10、EDN3、EDNRB和SNAI2。研究表明WS1型和WS3型主要由PAX3基因突变导致,患者表现为皮肤、毛发、虹膜等色素改变,先天性耳聋以及特征性表现内眦外移,WS3型还常合并肌肉、骨骼发育异常。30%的WS2型由MITF、SOX10、SNAI2基因突变引起,70%的WS2型患者病因不明,患者不表现为内眦外移。WS4型患者主要由SOX10、EDN3、EDNRB突变引起,常伴有先天性巨结肠等消化道改变。其中MITF作为关键分子与其它基因共同参与神经嵴的发育及黑色素细胞的形成和分化[8]。MITF基因位于3号染色体短臂p12.3-p14.1区域,存在9个可选择的启动子,能产生10种亚型的转录本,其中与黑色素细胞形成有关的是转录本MITF-M型[9]。该型包含9个外显子,广泛表达于黑色素细胞。其编码的MITF蛋白含有419个氨基酸,是一种含有螺旋-环-螺旋碱性亮氨酸拉链(basic-helix-loop-helix leucine zipper,b-HLH-Zip)结构的转录因子。HLH结构域由第201～261号的60个氨基酸组成,这一氨基酸序列高度保守并具有与DNA结合形成二聚体的功能。MITF以二聚体的形式激活色素细胞特异性基因TYR,使其表达黑色素合成关键酶酪氨酸酶,从而调控黑色素的合成与代谢[10]。

MITF突变以杂合为主,目前仅报道过2个WS家系为MITF纯合突变(纯合c.33+5G>C突变和纯合c.668G>A突变)。先证者为纯合c.33+5G>C突变,其父母均为杂合携带者且为近亲结婚,纯合患者表型比家系中杂合患者更重。纯合c.668G>A突变患者父母无症状,但先证者表现为比WS2型更为严重的WS4型[11,12]。在WS微型猪模型中,Mitf杂合突变表现为听力丧失、色素减退等,而Mitf纯合突变可导致更严重的无眼畸形[13]。此外,MITF纯合突变导致COMMAND综合征也有少量报道[14]。本例WS患者MITF基因7号外显子第649～651位核苷酸发生缺失突变(NM_000248,exon7,c.649_651delAGA),导致其编码的第217位精氨酸缺失,该突变位点已有多例报道,但尚无该位点的纯合病例。由于患者父母均未检测到该位点的突变,提示该突变为新发突变。研究表明,MITF的突变热点集中在7号和8号外显子,与b-HLH-Zip所在的区域对应,为DNA结合区。b-HLH-Zip结构的破坏会使得MITF与酪氨酸激酶启动子区域CATGTG的结合能力下降。我国报道的WS突变中c.649_651delAGA(p.R217del)和c.640C>T(p.R21411X)均被多次报道,推测可能为热点突变。p.R217del正好位于b-HLH-Zip结构域内,有文献报道该突变将影响MITF蛋白在细胞核中的定位,并产生显性负效应,影响野生型MITF蛋白的功能[4,15]。此外,MITF突变还可导致Tietz综合征和COMMAD综合征[14,16],并提高机体对黑色素瘤的易感性。MITF突变引起多种疾病的原因尚不明确,可能是个体差异或临床异质性,故仍定期随访。

我国Waardenburg综合征病例并不罕见,患者常因听力丧失而首诊于耳鼻喉头颈外科,故常由耳鼻喉科医师报道,皮肤科医师若缺乏与此病相关的理论知识将导致误诊或漏诊。由于WS2型患者常伴有先天性感音神经性耳聋,严重影响患者的生活质量,因此一旦怀疑此病应当及时开展基因检测以明确诊断。对于不伴有听力障碍的WS其它亚型患者,其皮肤、毛发、虹膜色素改变等体征也有利于诊断此病,可建议患者及早进行听力检查、遗传咨询、产前诊断等。