杨淑娟，史嘉琦，孙悦欣，李 璟，刘俊霞，杨志辉，孙志宏，白 梅

（内蒙古农业大学 乳品生物技术与工程教育部重点实验室 农业农村部奶制品加工重点实验室 呼和浩特 010018）

发酵乳因独特的风味和丰富的营养价值，故是乳制品行业中增长最迅速的产品之一。发酵乳必须具备一定的蛋白质含量、饱满滑爽的口感和良好的外观[1]。发酵乳制作是利用乳酸菌发酵，分解乳糖产生乳酸来改变牛奶的酸度，从而形成酸乳凝胶的过程。搅拌型发酵乳是发酵后的凝乳在灌装前搅拌成黏稠的组织状态。当牛奶的pH 值降到5.0 左右时，酪蛋白的高级结构被破坏，是由于此时氨基酸残基质子化造成的。同时，疏水分子与变性蛋白质相互作用，然后重新聚集在一起，酪蛋白的相互作用会使牛奶中的蛋白质形成半固态的网络结构，即形成了发酵乳[2]。有研究发现[3]，酪蛋白胶束是牛奶酸凝胶形成初期的主要驱动力，因此乳中的蛋白质，是形成发酵乳凝胶的基本物质，对发酵乳凝胶形成和所形成凝胶的微观结构、理化性质等有最直接的影响[4]。

光学微流变技术是一种在无扰和静态条件下，通过检测样品的后向散射光来表征分散体的流变性能和内部结构变化的分析技术。通过检测样品对给定波长激光的背散射散斑图像，可以得到分散体中粒子的运动状态，即均方根位移（Mean square displacement，MSD）与去相关时间（Decorrelation time，tdec）的关系，从而来表示分散体的流变特性[5]。微流变学可在不损坏样品的情况下研究样品的流变性能，可通过跟踪体系中颗粒的运动来表示样品的黏弹性变化。微流变学的灵敏度高于机械流变性学，目前已成功应用于凝乳酶诱导酪蛋白凝胶的流变学特性研究[6-7]。微流变学能够反映发酵乳流变学特性随时间的变化规律，发酵乳在发酵过程中的流变特性会影响产品的质构，从而影响口感[8]。

本文研究乳中蛋白含量分别为2.4%，2.8%，3.2%时对搅拌型发酵乳发酵过程中微流变特性及贮藏稳定性的影响，并做感官评价，以期探讨酸乳凝胶形成机理，实现对发酵乳产品凝胶强度等的预测，为产品的质量控制提供试验依据。

1 材料及方法

1.1 材料和试验菌种

纯牛乳（脂肪含量为3.7 g/100 g；蛋白质含量为3.0 g/100 g），蒙牛乳业（集团）股份有限公司；蔗糖，广西凤糖生化股份有限公司；浓缩牛奶蛋白（MPC-80）粉，德国穆勒有限公司；直投式酸奶发酵剂 【包括嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）S10 和德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckiissp.Bulgaricus）MGB58-5，由乳品生物技术与工程教育部重点实验室乳酸菌菌种资源库提供。

1.2 仪器与设备

博勒飞 DV-2T 粘度计，美国博勒飞公司；FE28 型pH 计，梅特勒（上海）有限公司；Rheolaser Master 型微流变分析仪，法国Formu-laction 仪器公司；SJ-CJ-2FDQ 超净工作台，苏州苏洁净化设备有限公司；恒温水浴锅，上海一恒科技有限公司；SRH60-70 高压均质机，上海申鹿均质机有限公司；TA-XT plus 质构仪，英国稳定微系统公司。

1.3 方法

1.3.1 发酵乳样品的制备 按照表1 的配方，分别将白砂糖、纯净水、MPC-80 完全溶解于纯牛乳中，作为发酵乳基料，分为3 组，加热至62 ℃，在20 MPa 条件下均质，95 ℃、5 min 杀菌后，在冰水冷却至42 ℃，以0.03‰接种量接种发酵剂。样品接种后于42 ℃恒温培养，至pH 4.6 以下为终点，立即冰水浴冷却，然后搅拌无菌分装。置于4 ℃后熟24 h 后于10 ℃条件下贮存21 d，贮藏期间每隔7 d 取样检测。

表1 不同蛋白含量发酵乳配料信息Table 1 Ingredients information of fermented milk with different protein content

1.3.2 发酵过程中流变学特性测定 利用光学微流变仪测定样品发酵过程中的流变学特性。在提前灭菌过的配套微流变仪样品瓶中，把接种发酵剂后的牛乳倒入，要维持样品瓶壁的干净，防止造成光学误差[9]。流变仪提前设置温度为42 ℃，将样品放入测定槽。每5 min 测量一次，至发酵终点。根据MSD 的曲线，能计算出来反映样品结构特征的4 种因子，即固液平衡因子（Solid liquid balance，SLB）、黏度因子（Macroscopic viscosity index，MVI）、弹性因子（Elastic index，EI）和流动因子（Fluidity index，FI）。

1.3.3 质构特性分析利用质构仪测定发酵乳在贮藏期间的稠度（Consistency）、硬度（Firmness）、黏度指数（Viscosity index）和内聚性（Cohesiveness）的变化情况。发酵乳样品用5 kg 测压元件进行压缩循环试验[10]。探头选用A/BE，试验中穿透深度为30 mm，速度固定为1 mm/s。样品从在10 ℃取出后恢复至室温后测定，每组平行设定为3 个[9]。

1.3.4 贮藏期稳定性分析

1.3.4.1 酸度测定[9]pH 值采用FE28 型pH 计直接测定；滴定酸度参照国家标准GB 5009.239-2016《食品安全国家标准 食品酸度的测定滴定酸度》中“酚酞指示剂法”进行测定，每个样品测定3组平行。

1.3.4.2 黏度测定[11]利用黏度仪测定发酵乳样品的黏度，使用4 号转子，扭矩设置为10%～100%，调节转子的转速为100 r/min，测定时间为30 s。每组测3 个平行。

1.3.4.3 持水性测定[11]在铺好有定量滤纸的漏斗中，倒入发酵乳样品，然后准确称取样品20.0 g，在室温的条件下放置2 h 后收集滤液并立即称量滤液的质量（g）。按如下公式计算：

持水性（%）=[1-（滤液质量/样品质量）]×100

1.4 感官评价[12]

感官评价挑选10 名专业的成员组成评价小组，分别从发酵乳的组织状态、口感、风味、色泽、喜爱程度5 个方面对产品进行感官评定，每一项20分，满分为100 分，具体评价打分的标准见表2。

表2 酸奶的感官打分标准Table 2 Sensory scoring standard of yogurt

1.5 统计分析

利用Rheolaser Master 型光学法微流变分析仪中所安装的Smart 软件对微流变数据进行处理分析。利用Orgin 2018 软件绘制文中的图表。试验数据利用SPSS 软件分析各样本间的差异，P<0.05 表示差异显著。

2 结果与讨论

2.1 发酵过程中微流变学特性

在流变学的范畴里，微流变学是一个崭新的模块，能够在微米的尺度研究样品的黏弹性特征。样品的构成可以通过微粒的运动痕迹来反馈。牛乳发酵过程中的微流变学是根据颗粒在乳液环境中的体积和运动情况来分析其流变特性的，在乳中接种发酵剂后，在最适的温度下，随着发酵的不断进行，乳环境中的酸度渐渐下降，这时候会使乳环境中原有的凝集体产生变化，酪蛋白颗粒会发生聚集，然后形成彼此有间隙的结构，最后会产生以酪蛋白胶体颗粒为基本构成的凝胶结构[13-14]。

2.1.1 SLB 变化 SLB 是指发酵乳在发酵过程中不同时间点所具有固态和液态特征的比值[15]，计算方法是依据MSD 平台的斜率进行的，表示微粒从进入空间到冲出空间的过程中的运动状态，斜率愈大对应着SLB 指数也愈大，表征微粒更具有液体属性[5]。SLB 与发酵乳样品的黏弹性呈现正相关的变化，可以表示产品的状态（倾斜于液态或固态）与时间对应的一种函数关系[11]，当0

发酵过程中SLB 的变化如图3所示，从发酵开始直至4.0 h，各组发酵乳样品的SLB 处于波动状态，此时样品为液体性质[16]。4 h 后，由于菌株持续产酸，酸度持续下降，出现SLB 拐点，表明单体酪蛋白重新聚集形成胶状颗粒，溶解度降低，黏度增加，达到样品的凝胶点。凝胶结构使样品的状态趋于固体，说明体系中胶体颗粒的迁移受到了酪蛋白聚集的影响。发酵接近尾声时，SLB 逐渐增加，然后趋于平稳，酪蛋白胶束最终凝结成三维网络结构[16]。

图3 不同蛋白含量发酵乳在发酵过程中MVI 示意图Fig.3 Schematic diagram of macroscopic viscosity index of yogurt with different protein content during fermentation

各组到达凝胶点由快到慢分别是蛋白含量3.2%，2.8%和2.4%组，说明蛋白含量增加有助于缩短到达凝胶点的时间。发酵终点时，发酵乳的SLB 从大到小排序依次为：蛋白含量3.2%，2.8%和2.4%组，蛋白含量3.2%组的SLB 最高，且3 组发酵乳SLB 在发酵终点时均<0.5，因此到发酵终点时，3 组发酵乳表现出较强的固体性质，而蛋白含量3.2%组发酵乳黏弹性更大。该结果表明，在一定范围内，蛋白含量越高的发酵乳样品对应的SLB 越大。

2.1.2 EI 变化 EI 体现弹性随时间发生变化的程度，根据MSD 曲线中平台高度的倒数求算得到，描述样品弹性特征，可快速、简便地表征一个样品的弹性模量。“笼”的减小对应着MSD 平台高度的下降，代表着网络结构构成得越为紧凑，表现的EI 值更高。MSD 平台的高度能够反映产品的弹性特征，EI 与样品的弹性模量G'成正比[5]。EI 值越大，凝胶的弹性越强，EI 与凝胶的性质有关[17]。

发酵过程中EI 变化如图2所示，从0 h 到4 h 左右，3 组样品的EI 维持在一个水平下，差异不明显，因为此时酪蛋白没有形成网状凝胶结构。随着发酵时间的增加，4 h 后，样品逐渐出现凝乳状态，蛋白含量3.2%组的弹性因子先出现拐点，接着蛋白含量2.8%组、2.4%组依次出现拐点，此时为凝胶点。这说明蛋白含量的增加在一定程度上可以到达加快凝胶点的时间，与SLB结果对应。随发酵时间增加，3 组发酵乳EI 先增加到最大值，这是因为发酵乳中酪蛋白完全解离并迅速聚集形成凝胶结构，使EI 达到最大[18]，有研究表明[19]酪蛋白胶束粒子的排空层会开始重叠，在两个粒子相互靠近时，在颗粒间的重叠区域中聚合物被排除出，粒子重叠区域间和溶液中的聚合物的浓度有差异，从而导致酪蛋白胶束粒子间的有效吸引增强，进而表现为EI 增加。最后各组EI 基本保持平稳状态直到发酵终点，该过程中蛋白含量3.2%组EI 始终低于另外两组，蛋白含量2.4%组的EI 略高于蛋白含量2.8%组。EI与凝胶弹性变化呈正比，因此蛋白含量2.8%组、2.4%组的凝胶弹性较强。该结果表明，在一定范围内，蛋白含量越高的发酵乳样品对应的EI 反而较低。

图2 不同蛋白含量发酵乳在发酵过程中EI 示意图Fig.2 Schematic diagram of elasticity index of yogurt with different protein content during fermentation

2.1.3 MVI 变化 MVI 反应样品在微米尺度的黏度特征[20]，通过MSD 最后部分的斜率计算，MVI 与样品宏观黏度成正比，因此直接反映发酵乳黏度的变化[15]。

图1 不同蛋白含量酸奶在发酵过程中SLB 示意图Fig.1 Schematic diagram of solid-liquid balance of yogurt with different protein content during fermentation

样品在发酵过程中的黏度因子的变化趋势示意图如图3所示，从发酵开始到发酵进行到4 h 左右，由于酪蛋白没有形成凝胶网络结构，所以这3 组的MVI 呈现波动的状态[8]。随后蛋白质含量3.2%组先出现拐点，蛋白含量2.8%组和2.4%组紧接着依次出现拐点，3 组样品的MVI 迅速升高然后缓和升高，达到最高值后基本维持稳定水平[12]。这是因为酪蛋白胶粒解离，凝胶在乳中逐渐开始形成，进入黏度迅速变化的范围，随后各组发酵乳样品的MVI 迅速上升至最大值，进入高黏度[21]阶段，使整个发酵乳形成相对稳定的凝胶系统。由图3 可知，发酵乳网络结构形成后各组最终形成了稳定的凝胶结构。发酵过程中蛋白含量3.2%组的MVI 大，而发酵终点时，蛋白含量2.8%组的MVI 最大，此时该组黏度最高，而蛋白含量2.4%组的黏度达最大值后又有小范围的降低，可能是因为形成的凝胶结构不稳定。

2.1.4 FI 变化 FI 变化能反映发酵乳样品中微观粒子运动的快慢，一种根据粒子运动的特征时间τ 计算的因子。液体试验开始时，颗粒的堆积结构被破坏。随着老化时间的增加，颗粒逐渐回到网络结构的老化过程，在流动性曲线上表现为逐渐下降和FI 因子平台的出现[5]。

高流动因子（约>10 Hz）表示此时样品为液态，低流动因子（约<10-2Hz）说明样品为固态，与固液平衡点的结果对应[12]。FI 与粒子运动呈正相关，前者越大则后者运动愈快，流动性愈强[22]，样品发酵过程中FI 的示意图见图4，从发酵开始到4.0 h，3 组样品的流动因子呈现波动的情况，此时属于液体特性。4.0 h 后蛋白含量3.2%组先出现拐点，说明其粒子运动较快，蛋白含量2.8%组和蛋白含量2.4%组紧接着出现拐点。前4 h 流动因子在102～103Hz 之间波动，4 h 后流动因子垂直降低到接近10-1Hz，然后接着缓和降低，降到10-2Hz后基本维持在这个范围不变，此时，发酵乳样品拥有高黏性液态的特点。到发酵终点，蛋白含量2.4%组的FI 最低，与MVI 结果相应。7 h 以后，各组FI都比较接近，说明此时发酵乳样为固态性质。

图4 不同蛋白含量发酵乳在发酵过程中FI 示意图Fig.4 Schematic diagram of fluidity index of yogurt with different protein content during fermentation

2.2 贮藏期稳定性分析

2.2.1 质构特性变化 本研究对3 种发酵乳样品在贮藏期的质构进行测定，以评价添加不同含量蛋白对发酵乳质地的影响（表2）。测定参数包括内聚性、稠度、黏度指数和硬度。在本研究中，蛋白含量2.8%组发酵乳在贮藏21 d 内始终具有最高的硬度，然后为蛋白含量3.2%组，最低是蛋白含量2.4%组，差异显著（P<0.05）。发酵乳的高稠度是指高密度的黏性产品，蛋白含量2.8%组稠度在贮藏期间始终显著高于另外两组（P<0.05），蛋白含量3.2%组次之，蛋白含量2.4%组稠度最低；贮藏期间，蛋白含量2.8%组内聚性最高（P<0.05），接下来是蛋白含量3.2%组、蛋白含量2.4%组，有研究表明发酵乳的凝胶组成强弱与内聚性是相关的，能够反映发酵乳保持水分的能力[23]；蛋白含量2.8%组的黏度指数在贮藏期间显著高于另外两组（P<0.05）。可以看出，蛋白含量2.8%组发酵乳质构状态最佳，而蛋白含量2.4%组发酵乳质构状态最差。

2.2.2 pH 值和滴定酸度变化 发酵乳的后酸直接影响成品的质量、风味与口感，产酸是酸奶发酵剂的主要功能[24]。pH 值和滴定酸度（TA）可反应发酵乳的酸度变化和后酸化的程度。

发酵乳在10 ℃贮藏过程中酸度的变化由图5可知，贮藏过程中各组pH 值均呈下降趋势，滴定酸度呈上升趋势。贮藏期间发酵乳pH 值均匀下降，蛋白含量3.2%组在贮藏期间的pH 值始终高于其它两组，同时因为蛋白含量越高，游离的氨基酸越多，所以滴定酸度越高，第14 天后3 组发酵乳滴定酸度值差异不显著（P>0.05）。

图5 酸奶在贮藏过程中酸度的变化情况Fig.5 Changes of acidity of yogurt during storage

2.2.3 黏度变化 黏度能够反映酸奶的质量，其是乳成分在发酵及贮藏过程中发生变化的映射。它直接影响发酵乳的口感，良好的感官品质离不开适宜的黏度[25]。

表3 酸奶贮藏期间质构参数分析Table 3 Analysis of texture parameters of yoghurt during storage

在贮藏过程中酸奶黏度的变化情况如下图所示，在贮藏21 d 的过程中，蛋白含量2.8%组的黏度均显著高于另外两组（P<0.05），这与发酵过程中MVI 变化结果所对应，而整体来看，随着贮藏时间的延长，3 组发酵乳的黏度在贮藏第14 天上升到最大后下降，而蛋白含量2.8%组的黏度始终最高，蛋白含量3.2%组黏度略大于蛋白含量2.4%组，差异不显著（P>0.05）。

图6 酸奶在贮藏过程中黏度的变化情况Fig.6 Changes of viscosity of yogurt during storage

2.2.4 持水力变化 发酵乳的持水性就是发酵乳的蛋白凝胶网络对水的保持能力，能力弱，则易发生乳清析出，酸奶质地差。酸奶的持水力能侧面反映凝胶网络的致密性及酸奶的质地，一般是呈正相关[26]。

贮藏期间发酵乳持水性的变化如图7所示，贮藏期间，蛋白质含量2.4%组发酵乳持水性最低，显著低于其它两组（P<0.05），蛋白质含量2.8%组和蛋白含量3.2%组持水性差异不显著（P>0.05），提示蛋白含量2.4%组发酵乳产品凝胶结构弱，持水性较差，而蛋白含量2.8%组和蛋白含量3.2%组的发酵乳持水性较好，组织状态好。

图7 酸奶在贮藏过程中持水性的变化情况Fig.7 Changes of water holding capacity of yogurt during storage

2.3 感官评定

发酵乳感官评定结果见图8，蛋白含量2.4%组的发酵乳和另外两组发酵乳在外观、口感、风味、组织状态和喜爱程度方面存在差异。蛋白含量2.4%组的发酵乳口感、风味、组织状态较差；而蛋白含量2.8%组和蛋白含量3.2%感官各项评分较高且喜爱程度较接近，整体来看组织状态均匀，口感顺滑细腻。蛋白含量3.2%组发酵乳口感稍偏酸，但酸奶醇香，黏稠丝滑；而蛋白含量2.8%组的发酵乳的口感最好，风味最佳，且质地醇厚。

图8 发酵乳感官评定直观图Fig.8 Direct view of sensory evaluation of fermented milk

3 结论

本研究采用多频扩散波谱法分析蛋白含量2.4%，2.8%和3.2%对搅拌型发酵乳发酵过程中微流变特性的影响，同时对其贮藏期间质构特性、稳定性和感官特性进行评价。微流变结果发现：蛋白含量越高，发酵乳越早出现拐点到达凝胶点，缩短了到达凝胶点的时间；随蛋白质含量的增加发酵乳具有较高的SLB 和较低的EI，对FI 没有显著影响，发酵终点时的MVI 变化显示蛋白含量2.8%组发酵乳黏度最高。贮藏期间的质构特性、黏度可以看出，蛋白含量2.8%组发酵乳具有最佳的质构状态，蛋白含量3.2%组的pH 值始终高于另外两组，蛋白含量2.4%组持水力显著低于另外两组，蛋白含量2.8%组和蛋白含量3.2%的发酵乳感官评分较高且较为接近。综上，不同蛋白含量的牛乳在发酵及贮藏过程表现出不同的特性，本研究对不同蛋白含量的相关发酵乳开发提供了理论指导和一定的科学参考。