李秀霞，马莹莹，蔡路昀，励建荣*，谢 晶，沈 琳

（1 渤海大学食品科学与工程学院 生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心 辽宁锦州 121013 2 浙江大学宁波科创中心 浙江宁波 315100 3 上海海洋大学食品学院 上海 201306 4 大连东霖食品股份有限公司 辽宁大连 116100）

褐藻多酚（Phlorotannin，PTN）是褐藻中多酚化合物的总称，红棕色粉末，为间苯三酚衍生物或聚合物，具有抗氧化、抑菌、降血脂等多种生物活性功能[1]。单宁酸（Tannic acid，TA）又称鞣酸，淡黄色粉末，易溶于水，分子中含有大量酚羟基，可与其它物质形成氢键及静电相互作用等，热稳定性增加[2]。山奈酚（Kaempferol，KAE）为黄色结晶状粉末，疏水性多酚，溶于热乙醇，具有抗氧化、抗癌、抗炎和抗菌等功效。以上3 种多酚均广泛应用于食品、保健品等领域[3]。然而，由于多酚类化合物携带大量活泼的酚羟基，性质不稳定，对pH 值和光照等环境因素敏感，易氧化失活[4]，因此，如何提高多酚的稳定性是其应用上所面临的难题。

人体消化道的pH 值由低到高逐渐递增，其中胃液pH 值约为1.2，小肠液pH 值约为6.8，开发不在胃中分解而在小肠中靶向释放的多酚包埋材料是多酚保健品研发的关键。酸度敏感性材料通常具有可解离成离子的基团，随着环境pH 值和解离程度发生变化。筛选合适的离子凝胶，可使阴阳离子聚合物通过电荷作用发生交联，凝胶化形成纳米颗粒。利用此种材料在不同pH 值条件下的收缩和膨胀性差异，可实现生物活性成分的肠道靶向释放。一些高分子聚合物具有这一靶向释放效果，壳聚糖-三聚磷酸钠凝胶在模拟胃液（SGF，pH=1.2）和模拟肠液（SIF，pH=6.8）中的体外药物释放试验表明其具有良好的pH 值响应性[5]，而海藻酸钠和壳聚糖等聚离子化合物形成的凝胶也具有相似的pH 值响应性释放效果[6]。氨基酸是生物分子最基本的单元，组氨酸、谷氨酸和天冬氨酸等带电荷氨基酸有着优异的生物学性质和特殊功能，可用于制备pH 值敏感性材料[7]。分子中含有大量氨基或羧基的聚氨基酸，具有超强的离子凝胶形成能力[8-9]。聚赖氨酸和聚谷氨酸形成的聚离子胶束在pH 6.8 时解离更快[10]，是良好的肠道靶向释放壁材。

为实现多酚在肠道中的靶向释放，本研究选取ε-聚赖氨酸和聚天冬氨酸通过正、负电荷作用制备pH 值敏感性离子凝胶，通过离子凝胶自组装作用将多酚封装到凝胶中，实现复合凝胶在偏酸性环境中保持稳定，在中性环境中膨胀释放包埋物的目的，以提高多酚的生物利用率。本研究内容对于多酚生物活性保持及其在食品及保健品开发中的应用具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

ε-聚赖氨酸（MW<5 000 u）购自上海麦克林生化科技有限公司；聚天冬氨酸（4 000 u

Free Zone2.5 真空冷冻干燥机，美国Labconco 公司；Q2000 差示扫描量热仪，美国TA 仪器有限公司；90Plus 纳米粒度分析仪，美国Brookhaven有限公司；Scimitar2000 傅里叶变换红外光谱仪，美国Agilent 公司；Ultima IV X 射线粉末衍射仪，日本Rigaku 公司；S-4000 场发射扫描电镜，日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1 ε-聚赖氨酸和聚天冬氨酸浓度比对凝胶浊度的影响 分别取5 mg/mL 的ε-聚赖氨酸水溶液5 mL 加入试管中，然后取5 mL 不同质量浓度的聚天冬氨酸水溶液（0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12 mg/mL）缓慢加入到试管中，另取一个试管加入5 mL 聚天冬氨酸水溶液，不加ε-聚赖氨酸水溶液，每个样本旋涡混合均匀，测定波长550 nm 处的吸光度[11]。

1.2.2 ε-聚赖氨酸和聚天冬氨酸质量浓度比对凝胶粒径与电位的影响 采用基于动态光散射技术的Zeta 激光粒度仪对1.2.1 节中的样品进行粒径与电位的测定，参数设定为：温度25 ℃，平衡时间2 min，分散剂为水，每个样品进行3 次试验，蒸馏水调零[12]。

1.2.3 负载多酚的ε-聚赖氨酸/聚天冬氨酸水凝胶的制备 准确称取一定量的山奈酚、单宁酸、褐藻多酚，将其分别溶于热乙醇、去离子水和无水乙醇，制成质量浓度均为0.1 mg/mL 的3 种多酚溶液。将3 mL 各溶液以及3 种溶液的混合液（3 种溶液各1 mL）依次加入5 mL 5 mg/mL 的ε-聚赖氨酸水溶液中，磁力搅拌并混合均匀，而后缓慢加入5 mL 1.2.1 节中优化出的最佳质量浓度聚天冬氨酸水溶液，使阳离子聚合物与阴离子聚合物发生静电相互作用，包封多酚，以不加多酚的溶液为空白对照，得到负载不同多酚的水凝胶溶液，真空冷冻干燥，备用。

1.2.4 包埋率与包载量的测定 取1.2.3 节中包埋过多酚的凝胶溶液5 mL 置于离心管中，4 500×g离心10 min，取1 mL 上清液于试管中，向试管中加入1.25 mL 的福林酚试剂，待其避光反应5 min 之后，再加入3.0 mL 10%碳酸钠溶液，并在室温下避光反应60 min 后，用紫外分光光度计测其在波长760 nm 处的吸光度值，根据多酚标准曲线方程换算出游离的多酚含量，以不加多酚的水溶液为对照，每个样品3 个平行。包埋率（LE）和包载量（LC）的计算公式如下：

式中，m总——多酚的总投入量，g；m游——溶液中游离的多酚量，g；m干燥——冷冻干燥之后微粒的质量，g。

1.2.5 粒径的测定 对1.2.3 节中的样品进行粒径的测定，每个样品进行3 次平行试验，用蒸馏水稀释与调零。

1.2.6 热稳定性的测定 通过差示扫描量热仪（DSC）检测样品的热变性温度与热焓值，称取5 mg 干燥后的粉末于坩埚中，压盖密封，空坩埚做对照，在氮气下，以10 ℃/min 的升温速率，从20℃加热到250 ℃恒温1 min，每组3 个平行。

1.2.7 X 射线粉末衍射的测定 利用射线衍射仪研究样品的晶体结构，将样品放在样品槽中压平，采用Cu-Kα 射线（λ=0.1542 nm）以10°/min 的速度进行连续扫描。扫描范围5°到90°，X 射线发生器的管流30 mA、管压36 kV，每组3 个平行[13]。

1.2.8 扫描电镜分析 将冻干的凝胶粉末固定在贴有导电胶的样品托盘上，并在真空下喷金，在3.0 kV 的电压下调整适当的倍数观察样品的微观形态。

1.3 统计分析

采用SPSS 20.0 软件对试验数据进行处理，均值比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）以及邓肯氏（Duncan's）法，取95%置信度（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 聚合物质量浓度比对水凝胶浊度的影响

聚合物溶液是澄清透明的，而带相反电荷的两种聚合物发生静电相互作用可能形成不可溶的物质[14-15]。浊度测定可以检测混合物中不溶性物的存在，ε-聚赖氨酸水溶液澄清透明，随着聚天冬氨酸质量浓度的增加，浊度先增加再降低（图1），直到聚天冬氨酸的质量浓度为5 mg/mL时，浊度达到最大3.143，浊度达到最大值时，溶液的电位接近于零，聚合物之间的静电斥力减小而发生聚集[11]，而浊度越大静电相互作用越强，物质被包埋的越完全，因此，聚天冬氨酸质量浓度为4～6 mg/mL 是适宜范围。

图1 聚天冬氨酸质量浓度对水凝胶溶液浊度的影响Fig.1 Effect of mass concentration of polyaspartic acid on turbidity of hydrogel solution

2.2 聚合物质量浓度对粒径和电位的影响

ε-聚赖氨酸和聚天冬氨酸的质量比不同，使得阴、阳离子聚合物上所带电荷密度比值发生变化，直接影响聚合物之间的静电相互作用，溶液的性质也会发生改变。从图2 可见，聚天冬氨酸的质量浓度为4～5 mg/mL 时粒径较大，此质量浓度下阴、阳离子之间存在较强的静电相互作用，可形成包裹活性物质的体系。随着聚天冬氨酸质量浓度的增加，溶液的电荷由正到负，当聚天冬氨酸的质量浓度为4 mg/mL 时，溶液的ζ 值为-0.83，溶液电荷接近于零。继续增加阴离子的质量浓度，电荷逐渐降低到-13.2，这表明阳离子聚合物已经完全与阴离子聚合物结合，增大阴离子的质量浓度后溶液中存在大量未结合的COO-，因此电荷为负[16]。齐宝坤等[17]研究发现溶液的|ζ|值越大，溶液表面带电荷越多，分子间排斥力越强，静电相互作用减弱，有效粒径降低，与本试验中的结果一致。

图2 聚天冬氨酸质量浓度对水凝胶溶液粒径与电位的影响Fig.2 Effect of mass concentration of polyaspartic acid on particle size and potential of hydrogel solution

2.3 包埋率与包载量的分析

包埋率是指在药物载体中所包封的药物总量，包载量是指药物载体系统单位重量的载药量。由图3 可知，山奈酚、褐藻多酚、单宁酸和3种多酚混合物的包埋率均达到80%以上，并且ε-聚赖氨酸-单宁酸-褐藻多酚-山奈酚-聚天冬氨酸组（ε-PL-TA-PTN-KAE-PASP）组的包埋率与另两组【ε-聚赖氨酸-褐藻多酚-聚天冬氨酸（ε-PL-PTN-PASP）和ε-聚赖氨酸-单宁酸-聚天冬氨酸（ε-PL-TA-PASP）】的包埋率相比显著降低（P<0.05），与ε-聚赖氨酸-山奈酚-聚天冬氨酸（ε-PL-KAE-PASP）的包埋率相比无显著性差异（P>0.05），这是因为山奈酚和褐藻多酚具有疏水性，而单宁酸是水溶性多酚，能更大程度的进入到ε-PL-PASP 溶液中，从而使包埋率增加。同时对其包载量的测定结果也更明显的表现出了这一特征，ε-PL-KAE-PASP 和ε-PL-PTN-PASP 的包载量显著降低（P<0.05），单宁酸的加入能够增加凝胶对山奈酚和褐藻多酚的包埋率与包载量，这可能是由于单宁酸的加入改变了溶液中粒径的大小，体系变得更加稳定，加强了包埋的效果。

图3 ε-聚赖氨酸/聚天冬氨酸水凝胶对褐藻多酚、山奈酚、单宁酸的包埋率和包载量的影响Fig.3 Effect of ε-polylysine/polyaspartic acid hydrogels on the encapsulation efficiency and loading capacity of polyphenols，kaepferol and tannic acid

2.4 粒径与电位分析

在未包封多酚之前的ε-PL-PASP 的粒径是824.61 nm（图4），包封山奈酚和褐藻多酚之后，凝胶粒径分别减小到411.03 nm 和628.43 nm，包封单宁酸之后粒径增加到2 160.33 nm，包埋3 种混合多酚的溶液粒径虽有所增加，但无显著性差异（P>0.05），这可能是因为山奈酚和褐藻多酚与ε-PL-PASP 之间的疏水相互作用使粒径减小[18]。单宁酸是亲水性多酚，加入之后能快速进入到ε-PLPASP 溶液中使粒径增加，3 种多酚混合之后由于疏水作用大于亲水作用粒径略微增加。由此可知，单宁酸的加入增进了凝胶对疏水多酚的包埋效果。

图4 负载不同多酚的ε-聚赖氨酸/聚天冬氨酸水凝胶溶液的粒径分布图Fig.4 Particle size distribution of encapsulation of different polyphenols in ε-polylysine-polyaspartic acid hydrogel solution

2.5 热稳定性分析

差示扫描量热法是一种热分析方法，通过温度范围的扫描可以测定各组分之间的热稳定性，热变性温度越高说明稳定性越强，破坏其结构所需的能量越大，△H值就越大[19]。由图5 可知，各样品组之间均有2 个放热峰，且第1 个峰比第2个峰更为明显，从表1 中可以看出，以未包封多酚的ε-聚赖氨酸/聚天冬氨酸（ε-PL-PASP）作为空白组，它的第1 个峰的热变性温度（Tm）为137.16℃，焓值（△H）为63.67 J/g，与空白组相比，包封单宁酸之后Tm增加，△H显著增加（P<0.05），包埋褐藻多酚和山奈酚之后水凝胶的Tm降低，△H无显著性差异（P>0.05），负载3 种混合多酚之后Tm降低，△H增加，峰形无明显的差异，这说明3 种多酚都被包封，并且以非晶态存在[20]。负载单宁酸之后溶液体系的稳定性更强，而山奈酚和褐藻多酚存在疏水基团，减弱了ε-聚赖氨酸/聚天冬氨酸之间的相互作用，导致溶液体系的稳定性变差。第2 个热变性温度在205～215 ℃之间，负载多酚之后Tm升高，△H增加，这说明破坏其结构所需要的能量更大。结果表明，ε-聚赖氨酸/聚天冬氨酸溶液体系能够达到包封不同多酚的作用，且更利于水溶性多酚的包封，3 种多酚混合之后亲水性多酚可以促进疏水性多酚的包埋[21]。

图5 负载不同多酚的ε-聚赖氨酸/聚天冬氨酸水凝胶溶液的DSC 图Fig.5 DSC of encapsulation of different polyphenols in ε-polylysine-polyphenol-polyaspartic acid hydrogel solution

表1 负载不同多酚的ε-聚赖氨酸/聚天冬氨酸水凝胶的热变性温度和焓值Table 1 Thermal denaturation temperature and enthalpy of encapsulation of different polyphenols in ε-polylysine- polyaspartic acid hydrogel

2.6 X 射线粉末衍射分析

X 射线粉末衍射是研究先进材料的结晶性质和成分的最常用的方法，原材料ε-聚赖氨酸（ε-PL）、聚天冬氨酸（PASP）、单宁酸（TA）、山奈酚（KAE）、褐藻多酚（PTN）以及ε-PL-PASP、ε-PLTA-PASP、ε-PL-PTN-PASP、ε-PL-KAE-PASP、ε-PL-TA-PTN-KAE-PASP 5 种水凝胶的XRD表征如图6所示，特征峰的尖锐度代表复合材料的结晶程度[22]。从图6 中可以看出，ε-聚赖氨酸的2θ=23.5°，聚天冬氨酸的2θ=20.3°，这是ε-聚赖氨酸和聚天冬氨酸特有的晶体结构，当ε-聚赖氨酸和聚天冬氨酸通过静电相互作用结合之后，原有的特征峰发生左移2θ=19.7°，并且在28.1°，31.2°，40.8°，55.7°，67.9°，72.8°和82.4°出现新的特征峰，根据布拉格方程d（Å）=λ/2sinθ（λ=1.54Å）得出对应间距d值为1.63，1.49，1.18，0.93，0.83，0.81，0.78 Å，这可能与ε-聚赖氨酸和聚天冬氨酸中CH 键和C=O 键的伸缩振动有关，也可能是NH+和COO-之间的静电相互作用所引起的[23]。负载不同多酚之后所有的特征峰均存在，19.7°的峰变得平缓，新的特征峰的峰值减小，这可能是由于ε-聚赖氨酸中的-NH2和多酚中-OH 之间氢键的形成有关，从而导致晶体结构被破坏。结果表明，不同的多酚以非晶态结构成功包裹在ε-聚赖氨酸/聚天冬氨酸水凝胶中。

图6 负载不同多酚的ε-聚赖氨酸/聚天冬氨酸水凝胶的XRD 图Fig.6 XRD of encapsulation of different polyphenols in ε-polylysine-polyphenol-polyaspartic acid hydrogel

2.7 微观形貌分析

负载不同多酚的ε-聚赖氨酸/聚天冬氨酸水凝胶的表面形貌如图7所示，从图7 中可以看出，由于ε-聚赖氨酸与聚天冬氨酸之间的静电相互作用，水凝胶内部呈现类似球状结构，这种结构能改善体系的稳定性，增强水凝胶的溶胀，达到包封不同生物活性成分的效果，更有利于药物的递送[24]。包封不同多酚之后微观结构发生很大的差异，负载单宁酸和3 种混合多酚的水凝胶呈现出大小均匀的球型结构，在水凝胶中分布松散的现象，这更好地说明了溶液体系的基质已经完全被生物活性分子所占据，单宁酸已经被包裹在溶液体系中。负载山奈酚和褐藻多酚之后球形结构出现黏连现象，并呈现聚集状态，表面平滑度降低，这可能是因为山奈酚和褐藻多酚属于疏水性物质与ε-聚赖氨酸/聚天冬氨酸之间的亲水基团发生静电斥力，导致一部分多酚滞留在溶液外而未被包裹，结果表明，ε-聚赖氨酸/聚天冬氨酸水凝胶对3 种多酚的包埋效果是单宁酸>3 种多酚混合物>褐藻多酚>山奈酚。

图7 负载不同多酚的的ε-聚赖氨酸/聚天冬氨酸水凝胶的扫描电镜图Fig.7 Scanning electron microscope（SEM）of encapsulation of different polyphenols in ε-polylysine-polyphenol-polyaspartic acid solution

3 结论

通过阳离子ε-聚赖氨酸和阴离子聚天冬氨酸之间的静电相互作用自组装成ε-PL-PASP 水凝胶，并应用于亲水性多酚单宁酸和疏水性多酚山奈酚、褐藻多酚及3 种多酚混合物的包封，并对包封多酚后凝胶的理化性能进行了分析。结果表明，在5 mg/mL ε-聚赖氨酸溶液中加入等量4 mg/mL 聚天冬氨酸溶液时，ε-聚赖氨酸/聚天冬氨酸水凝胶的稳定性最好；此聚合物体系更适合于亲水性多酚的包封，并且单宁酸的加入可以促进对疏水多酚的包埋；包埋单宁酸之后体系较稳定，而包埋山奈酚和褐藻多酚后体系稳定性差，热变性温度和焓值降低；多酚以无定形的非晶态结构包被于复合水凝胶中，包埋效果顺序为：单宁酸>3种多酚混合物>褐藻多酚>山奈酚。