杨 丽，孙小美，金梅林

华中农业大学动物医学院/ 生猪健康养殖协同创新中心，武汉 430070

产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）也被称为魏氏梭菌，是一种重要的人畜共患病原菌，广泛存在于自然环境中，可以通过消化道或呼吸道侵入机体，在肠道大量繁殖并产生多种毒素，导致肠道损伤，从而引起人或动物的魏氏梭菌病[1-2]。根据产生毒素种类和致病性的不同，主要分为A、B、C、D、E 5 个型[3-5]。

猪的产气荚膜梭菌病主要是由A 型、C 型引起的一种急性、致死性肠道传染病[6]。产气荚膜梭菌在生猪养殖中具有较高的发病率和死亡率，主要侵害1 周龄仔猪，俗称仔猪红痢；但是在育肥猪、母猪上也常有报道，感染后表现为血痢，腹部胀气，病程短，又称“猝死症”[1,6]。目前，养殖场针对产气荚膜梭菌的预防和感染主要使用抗生素，然而，随着抗生素耐药性的增加和国家减抗限抗的要求，产气荚膜梭菌防控问题更加突出。益生菌作为一种营养和免疫促进剂，广泛应用于饲料添加剂中，文献报道某些益生菌具有抑菌活性[7-10]，但益生菌对产气荚膜梭菌的抑制效果是否具有普遍性并不确定。

某大型猪场母猪发生零星、急性死亡的病例，发病猪出现胀气、排出气泡样红褐色液状粪便，根据流行特点、临床症状初步诊断为猪产气荚膜梭菌病，本研究采集粪便样品进行细菌的分离鉴定和药敏试验，同时检测了益生菌对产气荚膜梭菌的抑制作用，为产气荚膜梭菌的临床用药及防控提供理论依据和指导。

1 材料与方法

1.1 材 料

培养基、药敏纸片为商品化产品，益生菌为笔者所在实验室分离保存。

1.2 方 法

1）样品采集和细菌分离鉴定。采集的肛拭子棉签置于无菌EP 管中，加入强化梭菌液体培养基（RCM），37 ℃厌氧培养24 h，增菌培养液划线接种于强化梭菌固体培养基，37 ℃厌氧培养24～48 h，挑取单菌落纯化培养，革兰氏染色镜检；分离菌株接种于牛奶发酵培养基，46 ℃需氧培养2～5 h；水浴提取基因组模板，16 s 通用引物（27F/1492R）扩增鉴定。

2）分离菌株PCR 分型。采用试剂盒提取菌株基因组模板，PCR 分型引物参考文献[11]，具体引物序列见表1。

表1 产气荚膜梭菌主要毒素基因特异性引物

3）分离菌株药敏试验。采用药敏纸片琼脂扩散法测定分离菌株对抗生素的敏感性，每种药敏纸片3 个重复。

4）益生菌对产气荚膜梭菌抑制效果。复苏培养益生菌菌株，将灭菌牛津杯置于涂布有产气荚膜梭菌的TSA 培养基上，加入200 μL 益生菌发酵液，37 ℃培养20～24 h，观察益生菌对产气荚膜梭菌的抑制效果，测定抑菌圈直径，每株益生菌3个重复。

2 结果与分析

2.1 产气荚膜梭菌分离鉴定和培养特性

本研究采集肛拭子样品20 份，经过富集培养、平板划线分离共挑取80 个菌株进行鉴定，成功分离到4 株产气荚膜梭菌，编号为2#、17#、22#、25#，样品阳性检出率为25%。产气荚膜梭菌阳性肛拭子在增菌培养过程中会产生大量气体冲开EP 管盖，导致管内培养液减少，如图1 所示，在TSA 琼脂培养皿内的单菌落直径1～3 mm，边缘不整齐，菌落乳白色不透明，4 株菌菌落形态有差异。分离菌株进行革兰氏染色为阳性（图2），粗短大杆菌，两端钝圆，单个或成对排列，在实验室人工培养中未见芽孢形成，2#和17#菌株可观察到有荚膜形成，17#和25#菌株在液体培养过程中产气明显。分离菌株在牛奶发酵培养基中呈现产气荚膜梭菌特有的“爆裂发酵”现象（图3）。

图1 采集肛拭子在EP 管内增菌培养

图2 产气荚膜梭菌革兰氏染色光学显微照片（100X 油镜）

图3 产气荚膜梭菌在牛奶培养基中呈“爆裂发酵”

16s rDNA 序列经比对和产气荚膜梭菌同源性最高，因此，确定分离菌株为产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）。在MEGA6 中用邻接法构建系统发育树，对4 株菌的遗传进化关系进行分析，结果如图4 所示。

图4 分离菌株系统发育树

2.2 产气荚膜梭菌PCR 分型

4 株产气荚膜梭菌毒素基因PCR 分型鉴定结果如表2 和图5 所示，参考文献[4-5]，根据α、β、ε、ι 4 种最主要的致病性毒素，4 株菌分为3 个不同的类型，2#菌α、ε 阳性为D 型产气荚膜梭菌，17#菌α、β 阳性为C 型产气荚膜梭菌，22#和25#菌α、β、ε 阳性为B 型产气荚膜梭菌。此外，分离获得的4 株菌β2 毒素和肠毒素cpe 基因均为阳性，NetB 毒素阴性。

图5 产气荚膜梭菌毒素基因PCR 扩增结果

表2 4 株产气荚膜梭菌毒素基因PCR 分型结果

2.3 产气荚膜梭菌耐药性分析

本研究中测定4 株产气荚膜梭菌对8 类抗生素的敏感性，结果显示（表3），β-内酰胺类、喹诺酮类、四环素类、酰胺醇类和呋喃类对分离到的4 株产气荚膜梭菌均有不同程度的抑制作用，其中β-内酰胺中的头孢噻肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢呋辛、氨苄西林、羧苄西林，四环素类中的多西环素、米诺环素，酰胺醇类中的氟苯尼考抑菌效果好，抑菌圈直径在20 mm 以上。4 株菌对氨基糖苷类（阿米卡星、庆大霉素、链霉素）、大环内酯类（红霉素、麦迪霉素、阿奇霉素）、多肽类（杆菌肽、多粘菌素B）、磺胺类（复方新诺明、甲氧苄啶）及林可霉素完全耐药。氨基糖苷类中的新霉素、卡那霉素、丁胺卡那对2#和22#有较弱的抑制作用，但对17#没有抑菌效果。检测结果表明，抗生素对产气荚膜梭菌的抑菌效果具有菌株差异性，本研究中环丙沙星对22#菌株的抑菌直径为31.20 mm，但对25#菌株的抑菌圈直径只有11.09 mm。

表3 产气荚膜梭菌分离菌株抗生素敏感性 mm

续表3

2.4 益生菌对产气荚膜梭菌抑制作用

共检测17 个种属39 株益生菌对产气荚膜梭菌的抑制作用，结果如图6 所示：干酪乳杆菌-6、动物乳杆菌、植物乳杆菌、敏捷乳杆菌-1、卷曲乳杆菌、枯草芽孢杆菌-1、枯草芽孢杆菌-3、地衣芽孢杆菌对4 株产气荚膜梭菌均有抑制效果。综合比较，枯草芽孢杆菌-3 对产气荚膜梭菌的抑制效果较为突出，抑菌圈直径在15 mm 以上。

图6 益生菌对产气荚膜梭菌的抑制作用

3 讨 论

本研究分离获得的4 株产气荚膜梭菌在菌落形态、菌体形态和培养特性上具有差异，16s rDNA系统发育树分析发现4 株菌的遗传进化关系不同。根据产气荚膜梭菌毒素基因PCR 分型鉴定结果，4株菌分为3 个不同的类型，2#菌为D 型，17#菌为C 型，22#菌和25#菌为B 型，分离获得的4 株菌β2 毒素和肠毒素cpe 基因阳性，NetB 毒素阴性。在产气荚膜梭菌引起猪病的临床研究中，目前报道的只有A 型和C 型[3,8,12-15]，还未见B 型和D 型的报道，B 型和D 型主要引起羔羊痢疾和羊肠毒血症[16]。但不同动物源产气荚膜梭菌的跨物种传播已有研究报道，最近的一项研究发现，动物园狼能够感染鸡源产气荚膜梭菌并导致死亡[17]。本研究首次同时从猪的临床样品中分离到B、C、D 3 种毒素类型的产气荚膜梭菌，说明B 型和D 型也会引起猪的产气荚膜梭菌病，也说明了猪场产气荚膜梭菌感染的复杂性，给该病的预防和治疗带来了更大的挑战。

抗生素敏感性试验发现，β-内酰胺类、喹诺酮类、四环素类、酰胺醇类和呋喃类对4 株产气荚膜梭菌均有一定的抑制作用。董秀梅等[17]从临床病料中分离到1 株产气荚膜梭菌，药敏纸片结果显示，其分离株对氟苯尼考、头孢呋辛钠、头孢噻肟敏感，与本研究结果类似，但其分离株也对喹诺酮类（诺氟沙星、环丙沙星）敏感，而本研究中4 株菌对诺氟沙星不敏感，对环丙沙星的敏感性具有极大的菌株差异性。张疏桐等[18]的研究发现，产气荚膜梭菌对β-内酰胺类较为敏感，对阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素等氨基糖苷类耐药，与本研究结果一致。因此，在产气荚膜梭菌感染中，可优先考虑β-内酰胺类和氟苯尼考等药物。

在全球养殖限抗、禁抗的大背景下，益生菌作为抗生素的替代物之一，具有绿色、安全、有效的优点，拮抗病原菌的同时能够调节肠道菌群、维持和修复肠道物理和化学屏障、提高机体免疫力等[9-10,19]。在本研究采集样品的猪场中，根据临床症状初步确定为产气荚膜梭菌感染后，推荐猪场使用益生菌复合制剂，一段时间后，母猪整体的健康状态得到改善，出现胀气的母猪数量明显减少。因此，在成功分离获得产气荚膜梭菌后，检测了益生菌菌株的体外抑制效果。结果发现，益生菌对产气荚膜梭菌的抑制作用具有种属、菌株差异性[20]，其中，植物乳杆菌和动物乳杆菌对产气荚膜梭菌的抑制效果具有广谱性，植物乳杆菌对产气荚膜梭菌的抑菌机制已有研究报道[21]。相比较于乳酸菌，芽孢杆菌环境耐受性更强，本研究筛选到1 株枯草芽孢杆菌，对产气荚膜梭菌表现出较好的抑菌效果，其抑菌机制还需要进一步的研究。