石丽莉，郑 苏，单舒筠

(江苏省徐州医药高等职业学校，江苏 徐州 221116)

马鞭草科紫珠属植物大叶紫珠Callicarpa macrophylla Vahl，又名穿骨风、假大艾、止血草、白背木、赶风柴等，苗药称其为“豆嘎先”。其原植物为灌木，生于海拔110～2000 m的山坡路旁、疏林下或灌丛中，在我国广东、广西、海南、贵州、云南等省区均有出产，是一种野生的常用中草药。其味辛、苦，性平，归肝、肺、胃经，具有散瘀止血，消肿止痛之功效，主治衄血，咯血，吐血，便血，外伤出血，跌扑肿痛等症[1]。民间习用大叶紫珠根、枝、叶入药，鲜用或晒干；2010版药典将大叶紫珠作为新增品种收录记载，夏秋两季采摘其叶或带叶嫩枝，晒干入药。现代学者研究发现，大叶紫珠中含黄酮类、萜类、苯丙素类、甾体类等多种类型的化合物[2-5]，特别是萜类成分的细胞毒活性在抗癌方面显示其明显的治疗效果[3-6]，具有很高的药用价值。为了更深入阐明大叶紫珠中萜类成分的药效物质基础，本实验着重对大叶紫珠乙醇超声提取物进行了较系统的研究，从中分离鉴定出6个萜类化合物，分别为urs-12-en-3β-ol(1)、Oleanic acid(2)、14α,18-dihydroxy-7,15-isopimaradiene(3)、isopimaradiene-3β,18-diol(4)、3β-ace-toxy-urs-12-ene-11-one-12-ol(5)、ent-7α,16β,17,18-tetrahydrox-ykaur-15-one(6)。

1 仪器与材料

Bruker-DRX-600型核磁共振仪(瑞士Bruker公司)；Agilent 1260高效液相色谱系统，四元泵，DAD检测器，Agilent Chemstation色谱工作站(美国Agilent公司)；Buchi R-114旋转蒸发仪(瑞士步琦有限公司)；SK250HP超声波提取器(上海科导超声仪器有限公司)；Combi Flash Rf 200中低压快速分离色谱仪(美国Teledyne科技有限公司)；制备型HPLC(Shimadzu,Tokyo,日本)：泵Shimadzu LC-20AR、检测器Shimadzu SPD-20A、色谱柱Shim-pack RP-C18 column (10 μm, 200×20 mm)；中压色谱分离凝胶MCI(德国Merck公司)；薄层层析硅胶板HSGF254，GF254(青岛海洋化工有限公司)；凝胶柱层析Sephadex LH-20(美国GE公司)；柱层析填料硅胶(100～200目，青岛海洋化工有限公司)；HPLC分析使用色谱纯试剂，硅胶柱色谱洗脱等使用分析纯试剂。

2 提取与分离

称取大叶紫珠干燥叶5 kg，以适量95%乙醇超声提取2次，3 h/次，合并两次提取液，旋转蒸发浓缩至流浸膏，加水混悬。将混悬液依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取2～3次，将各溶剂层萃取液合并，回收溶剂，浓缩至浸膏状，真空干燥后记录各萃取层所得膏体的收率如下：石油醚层为2.9%、二氯甲烷层为50.5%、乙酸乙酯层为3.4%、正丁醇层为22.1%。取二氯甲烷萃取部位，采用常压硅胶柱色谱进行分离，依次用石油醚∶乙酸乙酯(100∶1→50∶1→30∶1→15∶1→10∶1→5∶1→2∶1→1∶1→1∶5)和乙酸乙酯梯度洗脱，TLC检测，合并相同Rf值的流分，得23个组分(Fr.1～Fr.23)。Fr.3有大量物质在甲醇中难溶，过滤得到化合物1(119.6 mg)。Fr.11经中低压快速分离色谱硅胶柱色谱(二氯甲烷∶甲醇，80∶1→1∶1)梯度洗脱后，得到5个组分(Fr.11-1～Fr.11-5)；Fr.11-2(73.1 mg) 经凝胶柱层析，二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脱得化合物2(49.3 mg)。Fr.20经中低压快速分离色谱C18柱色谱(甲醇-水，20%～100%)梯度洗脱后，得到7个组分(Fr.20-1～Fr.20-7)，Fr.20-5 (124.8 mg) 经Sephadex LH-20凝胶柱层析，甲醇洗脱得6个组分(Fr.20-5-1～Fr.20-5-6)；Fr.20-5-3(21.4 mg)经制备液相(波长203 nm；甲醇-水，62∶36；流速3 mL/min)得化合物3(8.2 mg)、化合物4(6.7 mg)。取乙酸乙酯萃取部位，经中低压快速分离硅胶柱色谱(二氯甲烷：甲醇，100∶1→1∶80)梯度洗脱后，得到9个组分(Fr.1～Fr.9)。Fr.3经中压色谱分离凝胶MCI，甲醇梯度洗脱后，在丙酮中重结晶得化合物5(10.8 mg)。Fr.8经中低压快速分离C18柱色谱(甲醇∶水，3∶7)洗脱得3个组分(Fr.8-1～Fr.8-3)，Fr.8-1在丙酮中重结晶得化合物6(10.2 mg)。

3 结构鉴定

3.1 化合物 1

该化合物为白色丝状晶体 (二氯甲烷), 醋酸酐-浓硫酸反应呈阳性 。1H-NMR(600 MHz, DMSO-d6)谱给出 1个烯氢信号δ5.12(1H, m, H-12), 且为环内双键；1个连氧叔碳原子上的氢信号δ2.46 (1H, m, H-3);6个甲基单峰氢信号δ：0.77(s，CH3)，0.80(s，CH3)，1.07(s，CH3)，1.25(s，CH3)，4.28(s，CH3)，5.08(s，CH3)和两个甲基双峰信号δ0.93(3H，d，J=6.0 Hz)，δ0.87(3H，d，J=6.0 Hz)。13C-NMR(151 MHz, DMSO-d6)谱给出1个连氧碳信号δ77.3(C-3);2个烯碳信号δ145.2 (C-13)，δ124.5(C-12)，表明该化合物为乌苏 -12-烯型五环三萜。13C-NMR(151 MHz, DMSO-d6)δ：58.9(C-18)，55.2(C-5)，47.6(C-9)，42.0(C-14)，41.4(C-22)， 40.0 (C-8)，38.8(C-19, 20)，36.8(C-1)，36.4 (C-4)，34.9 (C-10)，33.8 (C-17)，32.9(C-7)，31.2(C-21)，28.9(C-15)，28.6 (C-23)，28.0 (C-28)，27.4(C-2)，26.6 (C-16)，23.5(C-11)，23.4 (C-30)，21.7(C-27)，18.4(C-6)，17.8(C-29)，17.0(C-26)，16.5(C-25)，15.9(C-24)。13C-NMR谱数据与文献[7-9,18]报道的数据基本一致,故鉴定化合物1为urs-12-en-3β-ol(乌苏-12-烯-3β-醇)。

图1化合物11H-NMR谱图 图2化合物113C-NMR谱图

3.2 化合物 2

该化合物为白色粉末状固体。1H-NMR(600 MHz, CH3OH+D2O) (图3)给出 1个连氧原子上的氢信号δ5.64(C12-H)，1个羧基上的氢信号δ5.24(C3-OH)，7个甲基单峰氢信号δ：0.94(s，CH3)，0.97(s，CH3)，1.01(s，CH3)，1.07(s，CH3)，1.09(s，CH3)，1.53(s，CH3)，1.55(s，CH3)。13C-NMR (151 MHz, CH3OH+D2O) (图4)给出1个羧基碳信号δ180.0(C-28)，1个连甲氧基碳信号δ23.9(C-3)，其余碳信号δ：15.8(C-25)，16.3(C-24)，17.7(C-26)，19.5(C-6)，23.6(C-30)，23.9(C-11，16)，24.0(C-27)，24.5(C-2)，26.3(C-15)，27.8(C-23)，28.7(C-20)，31.6(C-7，22，29)，33.5(C-21)，33.8(C-10)，34.9(C-1)，38.1(C-4)，39.8(C-8)，42.7(C-18)，42.8(C-14)，46.6(C-17)，47.6(C-19)，47.9(C-9)，56.7(C-5)，79.7(C-3)，123.6(C-12)，145.2(C-13)。以上数据与文献报道[8,10-12]基本一致，故化合物2鉴定为oleanolic acid(齐墩果酸)。

图3化合物21H-NMR谱图 图4化合物213C-NMR谱图

3.3 化合物 3

该化合物为白色片状晶体。13C-NMR (151 MHz, CdCl3)与1H-NMR(600 MHz, CdCl3)谱数据见表1，与文献[13-19]报道的数据基本一致，鉴定该化合物为14α,18-dihydroxy-7,15-isopimaradiene(14α,18-二羟基-7,15-异海松二烯)。

3.4 化合物 4

该化合物为白色片状晶体。13C-NMR (151 MHz, CdCl3)与1H-NMR(600 MHz, CdCl3)谱数据见表1，与文献[13-19]报道的数据基本一致，鉴定该化合物为isopimaradiene-3β,18-diol(异海松二烯-3β,18-二醇)。

表1 化合物3、4 1H-NMR(600 MHz, CdCl3)与13C-NMR (151 MHz, CdCl3)数据

表1(续)

3.5 化合物 5

该化合物为白色晶体。1H-NMR(600 MHz, CH3OH+D2O)谱给出7个甲基单峰氢信号δ：0.83(s，CH3)，1.17(s，CH3)，1.18(s，CH3)，1.35(s，CH3)，1.57(s，CH3)，0.88(s，CH3)，0.89(s，CH3)和两个甲基双峰信号δ0.81(3H, d,J=6.5 Hz)，δ0.93(3H, d,J=6.5 Hz)。13C-NMR (151 MHz, CH3OH+D2O)谱图显示了32个碳信号，经无畸变极化转移增强(DEPT)谱进一步分析，将32个碳分类为9个非质子化碳，6个次甲基，8个亚甲基和9个甲基碳。其中氢信号δ2.05与碳信号δ20.9，δ170.8表明化合物结构中存在一个乙酰氧基；碳信号δ195.3推断化合物结构中存在一个酮基；碳信号δ144.5，δ134.4推断化合物结构中有一个双键。综合上述证据确证化合物5是一个含有乙酰氧基的三萜类化合物。对比查阅文献，13C-NMR谱数据与文献[18,20-22]报道，化合物5确证为3β-ace-toxy-urs-12-ene-11-one-12-ol (3β-乙酰氧基-urs-12-烯-11-酮-12-醇)。

3.6 化合物 6

该化合物为白色晶体。1H-NMR(600 MHz, CdCl3)谱给出2个甲基单峰氢信号δ：0.66(s，CH3)，1.02(s，CH3)；一个含氧次甲基的宽双峰氢质子信号δ3.66(dd，J=10.5，5.5 Hz) ；2个含氧亚甲基双重峰信号δ2.85/3.18与δ3.45/3.54；其余氢质子信号介于 0.93～4.78 ppm之间。13C-NMR (151 MHz,CdCl3)谱图显示该化合物20个碳原子的信号，经无畸变极化转移增强(DEPT)谱深入分析，碳信号δ219.2推断该化合物结构中有一个酮基；碳信号δ69.5推断化合物结构中有一个氧代次甲基； 碳信号δ61.3与δ69.7表明结构中含有两个含氧亚甲基；碳信号δ17.2与δ17.5表明结构中含有2个甲基；碳信号δ36.9,δ38.3,δ58.5和δ79.1处推断为结构中的4个季碳；除此之外，结构中还推论含有六个亚甲基，三个次甲基和四个羟基。综合上述分析结果，化合物6是一个二萜类化合物，查阅参考文献[8,14,20-24]，相应数据进行比对，基本完成1H-NMR和13C-NMR数据的归属，确证化合物6为ent-7α,16β,17,18-tetrahydrox-ykaur-15-one (ent-7α,16β,17,18-四氢甲苯-贝壳杉烷-15-酮)。

4 结论

通过对大叶紫珠Callicarpa macrophylla Vahl乙醇超声提取物的系统研究，分别自二氯甲烷及乙酸乙酯萃取物中分离得到六个萜类化合物(1～6)，并鉴定确证其骨架构型。六个萜类化合物结构式如下：

天然药物化学和生物学研究表明，中药材大叶紫珠中含黄酮类、萜类、苯丙素类、甾体类等多种类型的化合物。其中，萜类及其苷类的细胞毒活性在抗癌方面的治疗效果，具有很高的药用价值[2-5,14,20-22]。为了更深入阐明大叶紫珠中萜类物质的药效物质基础，本实验综合运用传统与现代化的分离纯化手段，以中低压快速分离色谱为主，多种色谱方法相结合，创建了一个快速、高效对大叶紫珠乙醇超声提取物系统研究的流程，以期在实践应用中发现更多大叶紫珠中含有的药效物质成分。