邹春燕，何焰鹏，柴秀坤，谢长顺，李 莉，付丽坤

原发性肝癌(PLC)是全世界癌症死亡最常见的原因之一。在发展中国家，如东亚、东南亚和中西非，PLC发病率最高，而在中南部、西亚、北欧和东欧地区，PLC发病率则较低[1]。通常，肝癌的发生与基因失调有关，可能与肝炎病毒感染、饮酒和肥胖等危险因素有关[2]。肝细胞癌(HCC)属于PLC的一种。近年来，由于诊断和外科技术的快速发展，HCC患者预后得到改善。但是，总体生存期还不够长[3]。阐明病因并研究HCC进展的重要分子机制对疾病的诊断、治疗和预后评估至关重要[4]。研究发现，CDC20可能作为一种癌蛋白促进人类癌症的发生和发展。CDC20在分化较差的肿瘤组织表达显着增强，并与胰腺癌[5]、肺癌、膀胱癌、结肠癌、口腔鳞状细胞癌和乳腺癌患者预后不良相关[6]。CDC20激酶抑制剂将有望成为候选的新型癌症治疗药物[7]。HCC组织CDC20表达上调可能与更高的血管浸润风险相关[8]。研究亦发现，CDC20编码的蛋白似乎是与细胞周期后期促进复合体/环体(APC/C)相互作用的调节蛋白，是后期启动所必需的有丝分裂出口[9]。CDC20调节因子直接与抗原提呈细胞(APC)结合并在有丝分裂和G1期激活细胞周期蛋白的泛素化活性。据报道，后期促进复合物(APC/C-Cdc20)或(APC/C-Cdh1)在有丝分裂期间通过多泛素化作用到达G1期[10]。故本研究应用生物学信息分析探索了CDC20表达与HCC发生的关系，将为HCC的早期发现和预后判断提供有用的分子标志物，也可能为HCC的治疗提供有效的药物作用靶点。

1 资料与方法

1.1 微阵列数据获取 使用关键词“HCC” 搜索Gene Expression Omnibus (GEO)数据集数据库(https://www.ncbi.nlm. Gov/geo/)，下载GSE36376基因表达谱。GSE36376检测平台为GPL10558_HumanHT-12_V4_0_R2_15002873_B，包括正常肝组织和HCC组织。将平台和系列矩阵文件作为txt文件下载。应用R软件包处理下载的文件，对数据进行校准、标准化和log2变换。

1.2 筛查差异表达基因(DEG) 应用RStudio中的R软件转换下载矩阵文件。将探针ID转换为国际标准的基因符号。应用R软件包中的Limma软件包对HCC和正常组织的DEG进行基因差异表达分析。将校正P值<0.05且倍数改变 (fold change)绝对值>2的样品认为是DEG。结果以txt文件形式保存以供后续分析。

1.3 PPI网络集成 STRING数据库(http://string-db.org/)是一个软件系统，通常用于识别已知蛋白质和预测蛋白质之间的相互作用。该数据库中的结果来自实验数据库、文本挖掘和预测生物信息学数据。每个节点是一个基因、蛋白质或分子，节点之间的连接代表了这些生物分子之间的相互作用，可以用来识别HCC组织DEG编码的蛋白质之间的相互作用和途径关系，中心节点对应的蛋白质可能是具有重要生理调节功能的核心蛋白或关键候选基因。

1.4 Metascape富集分析 Metascape在线富集分析工具(https://metascape.org)提供了基因富集分析平台，包含GO生物功能、KEGG信号通路和蛋白质互作网络分析等多种功能，应用MCODE法对Hub基因进行鉴定。

1.5 统计分析 应用GEO-2R分析GEO序列，应用Bonferroni、 Benjamini 和FDR方法调整P值。两组间差异采用t检验。P<0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 HCC差异基因鉴定情况 自GEO数据集数据库下载GSE36376信息及平台信息GPL10588(包括正常肝组织193例，HCC组织240例)。对HCC基因表达芯片数据集GSE36376进行标准化处理，应用Limma软件包(校正P<0.05，|logFC|>2)筛选GSE36376数据集，得到706个DEG。其中，共鉴定出554个下调基因和152个上调基因(其中前20个上、下调差异基因见表1、表2)。

表1 HCC组织前20个差异表达的上调基因

表2 HCC组织前20个差异表达的下调基因

2.2 应用MCODE筛选关键基因 应用MCODE构建HCC组织前20个差异表达上调基因中关键基因表达产物(图1)，显示关键基因是CDC20、UBE2C和HSP90AB1。

图1 MCODE筛选Hub基因情况

2.3 应用PPI网络分析HCC组织DEG情况 利用STRING数据库构建HCC组织DEG表达产物，去除孤立的和部分相连的节点后，构建了一个复杂的蛋白互作PPI网络(图2)。PPI网络是以蛋白为节点，参与同一代谢途径、生物学过程、结构复合体、功能关联或蛋白质间的物理接触作为边的网络。蛋白质通过相互作用构成网络参与生物信号传递、基因表达调节、能量和物质代谢及细胞周期调控等生命过程的各个环节。其中，上调基因UBE2C、CDC20、COL4A1、NUSAP1、HSP90AB1和CDKN3位于网络中心位置，推测这些基因参与了疾病的发展。

图2 PPI网络集成HCC组织DEG

2.4 Metascape富集分析情况 经Metascape富集分析表明，在GO生物过程中，主要集中在小分子分解代谢、一元羧酸代谢、类固醇代谢、辅因子代谢、药物分解代谢、初级酒精代谢、对有毒物质反应、有机阴离子转运、单糖代谢、芳香族氨基酸家族代谢、解毒、伯醇分解代谢、有机环状化合物分解代谢等过程；在KEGG信号通路，主要集中在碳代谢、脂肪酸降解、补体与凝血级联、色氨酸代谢和过氧化物酶体等过程(表3)。

3 讨论

目前，HCC占PLC的90%以上[11]，每年在全世界因HCC死亡者约75万人。特别是，约83%发生在发展中国家，在亚洲造成了重大的健康危机[12]。根据流行病学调查，HCC的发生可能与病毒性肝炎、饮酒、发霉的食物、有毒物质和遗传因素有关[13]。目前，越来越多的研究认为，HCC的发生和预后不良与基因异常表达有关[14]。由于多种基因通常参与细胞癌变过程，并且这些基因可以通过调节网络相互作用而发挥作用[15]，因此肝癌的具体发病机制目前尚未清楚。在基因水平、蛋白质水平和临床上应用生物标志物评估疾病显得极其重要。

表3 Metascape富集结果

CDC20过表达与前列腺癌、乳腺癌和结肠癌不良预后有关[6]。然而，CDC20在HCC组织表达仍缺乏足够的实验数据。本研究通过分析GEO数据库微阵列GSE36376数据集，发现CDC20主要节点在HCC分子相互作用网络中。我们探讨了HCC和正常肝组织CDC20表达水平。本研究显示CDC20在HCC显著表达，且属于上调基因。我们发现CDC20可能在肝癌的发生过程中起重要作用，与其他研究具有相似的结果[8]。从PPI网络中鉴定出DEG关系，显著上调基因是UBE2C、CDC20、COL4A1、NUSAP1、HSP90AB1和CDKN3。同时，我们使用MCODE法鉴定Hub基因，显示Hub基因是UBE2C、CDC20和HSP90AB1。据报道，在皮肤鳞状细胞癌，CDC20通过Wnt /β-catenin信号通路促进细胞增殖和迁移。CDC20可以通过促进LC3降解和抑制自噬促进心脏肥大[16]。曾报道 CDC20高表达可导致有丝分裂异常[17]。CDC20过表达可能有望加速细胞增殖并促进HCC发生和发展。CDC20表达被抑制的肝癌细胞被诱导在G2 / M期，可能是其抑制细胞生长的原因。研究还表明，在口腔鳞状细胞癌和结肠直肠癌组织检测到高CDC20表达[18]，其过表达可能预示患者预后不良。细胞分裂末期从有丝分裂中退出也需要CDC20。靶向CDC20治疗导致有丝分裂退出受阻，可能是一种比干扰药物更有效地杀死癌细胞的治疗策略[19]。 CDC20可能作为一种癌蛋白促进人类癌症的进展，是有希望的治疗靶点[20]。尽管CDC20在几种人类癌症的发生和预后方面的作用已得到深入研究和证实，但有限的研究已经肯定了其在HCC发生和发展过程中的潜在功能。本研究经过Metascape富集分析表明，在GO生物过程中，主要集中在小分子分解代谢、一元羧酸代谢、类固醇代谢、辅因子代谢、药物分解代谢、初级酒精代谢、对有毒物质反应、有机阴离子转运、单糖代谢、芳香族氨基酸家族代谢、解毒作用、伯醇分解代谢和有机环状化合物分解代谢等。在KEGG信号通路中，其主要集中在碳代谢、脂肪酸降解、补体与凝血级联、色氨酸代谢和过氧物酶体等过程，为探索HCC发生的分子机制提供了依据。