黄淡霞，招志辉，萧月兴，何艳青

随着饮食结构的改变运动量的减少，高热量饮食在日常饮食中所占比例不断升高，造成非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)发病率逐渐升高[1,2]。若NAFLD患者得不到及时治疗会发展为脂肪性肝炎、肝硬化，甚至肝癌[3]。现阶段，对于NAFLD的治疗尚未出现公认有效的药物，主要依靠调整生活饮食、运动，再结合采用胰岛素增敏剂进行辅助治疗[4]。因此，寻找新的有效治疗NAFLD的药物成为现阶段研究的重点之一。盐酸小檗碱(berberine, BBR)又名黄连素，其基本结构为苯基四轻基喳琳。临床上，主要用于治疗腹泻和炎症性疾病[5]。研究表明BBR还具有降低血脂、血糖并改善胰岛素活性，促进胰岛β细胞再生作用[6]。因此，我们推测BBR对NAFLD可能具有潜在的治疗效果。本研究应用BBR处理高脂饮食诱导的NAFLD大鼠，观察了其对肠道菌群、相关细胞因子和肝组织学的变化，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物、药物、试剂与仪器 6周龄SPF级SD大鼠45只，体质量为(200±20)g，购于广东医学院实验动物中心(粤监证字2018A029号，许可证号：SYXK2018-0056)，严格遵循实验动物管理办法进行实验。高脂饲料和常规饲料购自西南医科大学实验动物中心；小檗碱(纯度>98%)购自上海源叶生物科技公司；16Sr DNA引物由上海生工公司合成；检测血生化试剂盒购自北京中生生物试剂公司；检测白细胞介素-6(IL-6)、IL-10、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)试剂盒购自美国Sigma公司。使用德国Siemens 公司提供的DimensionRel MAX全自动生化分析仪、湖南平凡科技有限公司提供的TGL-15M型离心机、上海永科光学仪器有限公司提供的ZOOM-900型连续变倍立体显微镜和长沙益广制药机械公司提供的LD-66型实验室切片机。

1.2 动物模型的建立 取大鼠，适应性喂养1 w。采用随机数字表法将动物分为对照组、模型组和小檗碱处理组，每组15只。在对照组，给予普通饲料喂养，在实验组则使用等量高脂饲料喂养，自由饮水[7]。在16 w后，在两实验组各选择2只动物，禁食12 h，处死，迅速开腹，取肝组织行病理学检查。

1.3 药物干预 在证实完成造模后，在小檗碱处理组，使用5%羧甲基纤维素钠溶解小檗碱，150 mg.kg-1灌胃，1次/d，连续灌胃16 w；在模型组，仅给予等量的5%羧甲基纤维素灌胃处理。在完成干预后，采用颈椎脱臼法处死所有大鼠，取血，使用全自动生化仪检测空腹血糖(FPG)和空腹胰岛素(FINS)水平，计算胰岛素抵抗指数(IRI)[8]；取肝脏组织，行病理学检查[9]。

1.4 16SrRNA序列分析 在处死大鼠前24 h，取粪便，置于离心管，加入0.01 mol/L磷酸盐缓冲液、混匀，4℃、200 g离心5 min，取上清，加入磷酸盐缓冲液1 mL，12000 r/m离心1 min；提取粪便DNA，以细菌8F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1391R(5′-GACGGGCGGTGTGTRCA-3′) 为引物，扩增16SrRNA基因[10]。采用实时荧光定量PCR法扩增，条件为95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 20 s，40个循环。72℃ 30 s。以2-ΔΔCt表示mRNA相对水平。

1.5 血清检测 取血清，使用全自动生化分析仪检测血生化指标；采用ELISA法检测血清细胞因子水平。

2 结果

2.1 各组肝组织学变化 对照组大鼠肝组织细胞排列整齐，细胞核清晰，未见脂滴；模型组肝组织出现炎症细胞浸润和肝小叶结构破坏，肝细胞出现泡性脂肪滴；小檗碱处理组炎性细胞浸润显著改善，只存在少量的炎性细胞浸润和细胞内脂滴(图1)。

图1 各组大鼠肝组织病理学改变(HE， 400×)①：对照组；②模型组；③小檗碱处理组

2.2 各组大鼠血生化指标比较 与对照组比，模型组大鼠血清ALT、AST和LDL水平显著升高，而HDL水平显著降低(P<0.05)；与模型组比，小檗碱处理组大鼠血清ALT、AST和LDL水平均显著降低，而HDL水平均显著升高(P<0.05，表1)。

2.3 各组大鼠空腹血糖、胰岛素和胰岛素抵抗指数比较 与对照组比，模型组大鼠空腹血糖、空腹胰岛素和胰岛素抵抗指数均显著升高(P<0.05)；与模型组比，小檗碱处理组大鼠空腹血糖、胰岛素和胰岛素抵抗指数均显著降低(P<0.05，表2)。

表2 各组大鼠血糖指标比较

2.4 各组大鼠肠道菌群的变化比较 与对照组比，模型组大鼠肠道毛螺旋菌属和梭菌属均显著升高，而瘤胃球菌和乳酸菌属水平显著降低(P<0.05)；与模型组比，小檗碱处理组大鼠肠道毛螺旋菌属和梭菌属水平均显著降低，而瘤胃球菌和乳酸菌属水平显著升高(P<0.05，表3)。

2.5 各组大鼠血清细胞因子水平比较 与对照组比，模型组大鼠血清IL-6和TNF-α水平显著升高，而血清IL-10水平显著降低(P<0.05)；与模型组比，小檗碱处理组大鼠IL-6和TNF-α水平显著降低，而IL-10水平显著升高(P<0.05，表4)。

3 讨论

在生理情况下，肠黏膜作为一道生物屏障，可有效防止有害因素的直接侵入[11]。然而，在高脂饮食等不利因素的影响下，使得肠黏膜屏障受损，不仅会加速内毒素等有害物质进入血液，而且对脂质代谢也有一定的影响。本研究发现，BBR处理能显著改善肝组织炎症浸润，同时空腹血糖、胰岛素和胰岛素抵抗指数均显著下降，说明小檗碱可以有效改善大鼠的糖代谢紊乱，但小檗碱作为一种止泻剂较难被吸收，因此小檗碱应该是在胃肠道起作用，通过改善肠道菌群，实现对糖代谢的调节。

肥胖与肠道菌群的关系密切。在通常情况下，肥胖者肠道厚壁菌门多于拟杆菌门[12]。厚壁菌门菌包括各种革兰氏阳性细菌，较为常见的有毛螺旋菌属和梭菌属等[13]。拟杆菌门在肠道中较为常见的主要包括瘤胃球菌属和乳酸菌属。研究指出，乳酸菌属能通过提高脂肪细胞因子基因水平，减少三酰甘油在脂肪组织内堆积[14]。本研究检测了大鼠肠道粪便菌群发现，与模型组相比，小檗碱处理组大鼠肠道毛螺旋菌属和梭菌属水平均明显降低，而瘤胃球菌和乳酸菌属水平明显升高，提示小檗碱能提高拟杆菌门的丰度并降低了厚壁菌门的丰度。研究表明，小檗碱在体外能降低拟杆菌门和放线菌门丰度，而能提高变形菌门丰度。虽然本实验研究在大鼠体内进行，但实验所得的结果与前述报道相一致。

使用小檗碱处理大鼠后，血清ALT、AST和LDL水平均显著降低，而HDL水平显著升高，提示大鼠肝脏功能和血脂得到了显著的改善。因为小檗碱进入肠道后难以被吸收进入血液，因此其改善肝功能的作用应该不是小檗碱的直接作用，而是通过改善肠道菌群的分布，调节了脂质代谢和糖代谢，有效加快了肝细胞对脂滴的分解，缓解了脂肪变程度，使得大鼠肝功能得到了有效的改善[15-17]。

已有研究显示，持续的低水平炎症状态是NAFLD关键和内在的发病机制，因此检测炎症反应情况可以在一定程度上反映疾病的进展状况[17]。目前，研究较多的促炎细胞因子主要包括TNF-α、IL-1β和IL-6等，而抑制性细胞因子主要包括IL-2、IL-12、IL-4和IL-10等[18,19]。本研究发现，与模型组相比，小檗碱处理组动物血清IL-6和TNF-α水平显著降低，而血清IL-10水平显著升高，提示小檗碱一方面可以提高抑炎细胞因子水平，另一方面能抑制促炎细胞因子水平，从而降低大鼠体内过度激活的炎症反应。研究表明，通过调节大鼠肠道微生物状况可有效减少大鼠肝组织脂肪堆积，缓解NAFLD损伤[20]，本研究结论与其相一致。

综上所述，应用小檗碱处理动物，可能通过调节肠道菌群，抑制了大鼠体内炎症反应，有效缓解了高脂饮食所诱导的NAFLD病变，值得进一步研究。