张梦瑶，牛 姝，蔡 静，张立香，赵志刚*

1.石家庄市人民医院 内分泌二科，河北 石家庄 050000；2.河北医科大学附属第二医院 心内科，河北 石家庄 050000

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病的一种慢性并发症，多数糖尿病患者患有DN[1-2]。目前，DN的发病率仍在上升[3]。DN发生的分子机制尚未清楚。据报道，足细胞损伤发生在DN的早期阶段，从而触发肾功能损害并导致蛋白尿的发生[4]。因此，迫切需要找到一种治疗高糖(high glucose，HG)诱导的足细胞损伤的有效方法。

许多膳食植物化学物质可用于抑制DN，如丹参酮ⅡA(tanshinone ⅡA，Tan ⅡA)可通改善链脲佐菌素诱导的DN[5]。Tan ⅡA是一种从丹参中分离出的化学物质，具有抗氧化、抗炎等多种药理作用[6]。然而，Tan ⅡA用于治疗DN的证据仍然有限。

研究证实，Tan ⅡA可通过激活沉默信息调节蛋白1(silent information regulator 1，SIRT1)/内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)通路缓解过氧化氢诱导的血管内皮细胞衰老[7]。因此，推测Tan ⅡA可能通过激活SIRT1/eNOS通路对HG诱导的足细胞损伤发挥保护作用。本研究拟用HG诱导小鼠足细胞(MPC-5细胞)损伤模型，探索Tan ⅡA对氧化应激和细胞凋亡的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞:永生化小鼠足细胞系MPC-5细胞(上海雅吉生物科技有限公司)；

1.1.2 试剂及试剂盒:Tan ⅡA(分析标准品，纯度≥99%，上海阿拉丁试剂有限公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(HyClone公司)；重组小鼠干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)(Prospec公司)；RPMI-1640培养基[爱必信(上海)生物科技有限公司]；CCK-8试剂盒和Annexin-FITC/PI凋亡检测试剂盒(Dojindo公司)；SIRT1抑制剂Sirtinol(纯度：≥98.0%)(MedChemExpress公司)。RIPA裂解液(北京YITA公司)；BCA蛋白质定量试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司)；抗-Bcl-2，、Bax，抗体、裂解的caspase-3、p-SIRT1、p-eNOS和GAPDH以及辣根过氧化物酶偶联的第二抗体(Cell Signaling Technology公司)；增强型ECL化学发光试剂盒(Vazyme公司)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)测定试剂盒(微板法)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)测定试剂盒(WST-1法)、过氧化氢酶(catalase，CAT)测定试剂盒(可见光法)含量测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养及分组处理：将MPC-5细胞用含有10% FBS和104U/L IFN-γ的RPMI-1640培养基于33 ℃、5% CO2加湿培养箱中培养。为了诱导分化，将MPC-5细胞在不含IFN-γ的RPMI-1640培养基中于37 ℃培养10～14 d，处理前将分化的MPC-5细胞血清饥饿过夜，进行同步化。

在实验开始之前，为了研究Tan ⅡA对HG作用下MPC-5细胞活力的影响，首先将细胞分为NC组(5.5 mmol/L D-葡萄糖)、渗透压对照(MA)组(5.5 mmol/L D-葡萄糖和22.5 mmol/L甘露醇)、HG组(25 mmol/L D-葡萄糖)、HG+Tan ⅡA 5、10、15 μmol/L组(25 mmol/L D-葡萄糖和5、10、15 μmol/L Tan ⅡA)，仅用于CCK-8实验，以选择出Tan ⅡA最适浓度。

将细胞再次分为NC组、MA组、HG组、HG+Tan ⅡA组(25 mmol/L D-葡萄糖和10 μmol/L Tan ⅡA)和HG+Tan ⅡA+Sirtinol组(25 mmol/L D-葡萄糖、10 μmol/L Tan ⅡA和20 μmol/L Sirtinol[9])，用于研究Tan ⅡA是否通过SIRT1/eNOS通路影响HG诱导的足细胞凋亡和氧化应激反应。

1.2.2 CCK-8测定细胞活力：将MPC-5细胞接种于96孔板，细胞数为5×103个/孔，用正常浓度葡萄糖(5.5 mmol/L D-葡萄糖)培养24 h后，添加不同剂量的Tan ⅡA(0、5、10、15 μmol/L)[8]再处理24 h，然后在每孔中添加10 μL的CCK-8溶液，37 ℃培养3 h。用酶标仪检测各孔细胞在450 nm波长处的吸光度值。细胞活力=实验组吸光度值/对照组吸光度值×100%。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡：将MPC-5细胞处理48 h，各组6个复孔。药物处理后，使用结合缓冲液悬浮细胞，调整细胞浓度为5×105个/mL，吸取200 μL细胞悬液，依次添加10 μL Annexin-FITC和PI，在室温下避光孵育10 min，然后将收获的细胞重新悬浮在500 μL结合缓冲液中，行流式细胞术检测，用FlowJo软件分析凋亡细胞的百分比，统计细胞凋亡率。

1.2.4 Western blot分析凋亡相关和SIRT1/eNOS通路蛋白表达：MPC-5细胞处理48 h，各组6个复孔。药物处理后，使用RIPA裂解液从细胞中提取蛋白质，用BCA法行蛋白质定量。取等量的蛋白质进行10% SDS-PAGE分离；将分离的蛋白质转移到PVDF膜上并在5%牛血清白蛋白中封闭1 h，然后，将转移过蛋白质的PVDF膜在抗Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、p-SIRT1、p-eNOS和GAPDH抗体中于4 ℃孵育过夜。使用TBST洗膜去除一抗，并与辣根过氧化物酶偶联的二抗在室温下孵育1.5 h。使用增强型的化学发光试剂盒观察蛋白质条带，并用NIH Image J软件进行定量。以GAPDH为内参计算目标蛋白质的相对表达。

1.2.5 氧化应激相关标志物水平检测：按照试剂盒说明书检测上述各组MPC-5细胞中MDA、SOD及CAT含量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 Tan ⅡA提高HG诱导的足细胞活力

与Tan ⅡA 0 μmol/L相比，Tan ⅡA 5、10或15 μmol/L对MPC-5细胞活力的影响均无差异。与NC组相比，MA组MPC-5细胞活力也无显著性变化，HG组MPC-5细胞活力显著降低(P<0.05)。与HG组相比，HG+Tan ⅡA 10 μmol/L组和HG+Tan ⅡA 15 μmol/L组细胞活力显著增高(P<0.05)，且呈剂量依赖性(图1)。选择剂量为10 μmol/L的Tan ⅡA用于后续的实验。

NC.negative control；MA.mannitol；HG.high glucose；Tan ⅡA.tanshinone ⅡA; *P<0.05 compared with MA group; #P<0.05 compared with HG group图1 CCK-8法检测Tan ⅡA对HG诱导的MPC-5细胞活力的影响Fig 1 The effect of Tan ⅡA on the viability of HG-induced MPC-5 cells by CCK-8

2.2 Tan ⅡA缓解HG诱导的足细胞凋亡及蛋白表达

与NC组相比，MA组MPC-5细胞凋亡率和细胞中Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3蛋白水平无差异；与MA组相比，HG组MPC-5细胞凋亡率增高，细胞中Bcl-2蛋白水平下降，Bax和cleaved caspase-3蛋白水平增高(P<0.05)；与HG组相比，HG+Tan ⅡA组MPC-5细胞凋亡率降低，细胞中Bcl-2蛋白水平升高，Bax和cleaved caspase-3蛋白水平降低(P<0.05)；与HG+Tan ⅡA组相比，HG+Tan ⅡA+Sirtinol组MPC-5细胞凋亡率增高，细胞中Bcl-2蛋白水平下降，Bax和cleaved caspase-3蛋白水平增高(P<0.05)(图2)。

2.3 Tan ⅡA减轻HG诱导的足细胞氧化应激反应

与NC组相比，MA组MPC-5细胞中MDA、SOD和CAT水平无差异；与MA组相比，HG组MPC-5细胞中MDA水平增高，SOD和CAT活性降低(P<0.05)；与HG组相比，HG+Tan ⅡA组MPC-5细胞中MDA水平降低，SOD和CAT活性升高(P<0.05)；与HG+Tan ⅡA组相比，HG+Tan ⅡA+Sirtinol组MPC-5细胞MDA水平升高，SOD和CAT活性降低(P<0.05)(图3)。

2.4 Tan ⅡA对HG诱导的足细胞发挥保护作用

与NC组相比，MA组MPC-5细胞中p-SIRT1和p-eNOS蛋白水平无差异；与MA组相比，HG组MPC-5细胞中p-SIRT1和p-eNOS蛋白水平降低(P<0.05)；与HG组相比，HG+Tan ⅡA组MPC-5细胞中p-SIRT1和p-eNOS蛋白水平升高(P<0.05)；与HG+Tan ⅡA组相比，HG+Tan ⅡA+Sirtinol组MPC-5细胞p-SIRT1和p-eNOS蛋白水平降低(P<0.05)(图4)。

3 讨论

HG诱导的足细胞活力降低和细胞凋亡增加是足细胞耗竭的主要原因，在DN的发病机制中起着重要的作用[10]。Tan ⅡA可作为一种的抗癌药物，可显著降低肿瘤细胞的存活、迁移和增殖[11]。本研究发现， HG诱导后， MPC-5细胞活力降低， 凋亡率升高，且Bcl-2水平降低，Bax和cleaved caspase-3水平升高。Tan ⅡA改善HG对MPC-5细胞的影响，表明Tan ⅡA在HG条件下对足细胞具有保护作用。有研究报道，凋亡时抗凋亡蛋白(如Bcl-2、Bcl-xL)和促凋亡蛋白(如Bax和Bad)之间的平衡被破坏，线粒体膜通透性增加，释放细胞色素C进入细胞质，激活下游caspases家族。caspase-3是最主要的效应caspase[12]。以上说明，Tan ⅡA可能通过线粒体凋亡途径保护MPC-5细胞免受HG诱导的细胞凋亡。

A,B.Flow cytometry detection of apoptosis；C,D.Western blot detection of Bcl-2, Bax and cleaved caspase-3 protein levels; NC.negative control；MA.mannitol；HG.high glucose；Tan ⅡA.tanshinone ⅡA; *P<0.05 compared with NC group; #P<0.05 compared with MA group; △P<0.05 compared with HG group; ▲P<0.05 compared with HG+Tan ⅡA group

NC.negative control；MA.mannitol；HG.high glucose；Tan ⅡA.tanshinone ⅡA; *P<0.05 compared with NC group; #P<0.05 compared with MA group; △P<0.05 compared with HG group; ▲P<0.05 compared with HG+Tan ⅡA group

NC.negative control；MA.mannitol；HG.high glucose；Tan ⅡA.tanshinone ⅡA; *P<0.05 compared with NC group; #P<0.05 compared with MA group; △P<0.05 compared with HG group; ▲P<0.05 compared with HG+Tan ⅡA group

氧化应激与DN发展中足细胞损伤密切相关。MDA是脂质过氧化的最终产物，SOD和CAT是抗氧化应激防御系统中的抗氧化酶，它们共同抵抗HG诱导的足细胞死亡[13]。本结果显示，HG诱导后MPC-5细胞MDA水平升高，SOD和CAT水平降低，而Tan ⅡA干预可削弱这种影响。表明Tan ⅡA通过调控氧化应激减轻了HG诱导的足细胞损伤。此外，SIRT1属于Sirtuin蛋白家族，可通过调节转录因子、协调因子和蛋白质活性，进而为促炎和氧化应激途径提供“应激抵抗”[14]。SIRT1可增强eNOS的酶活性，SIRT1和eNOS在调节内皮功能和防御氧化应激方面的相互作用已被广泛报道[15]。结果显示，HG诱导后p-SIRT1和p-eNOS水平降低，而Tan ⅡA干预后p-SIRT1和p-eNOS水平增高，表明Tan ⅡA可能通过激活SIRT1/eNOS通路对HG诱导的组细胞发挥保护功能。进一步的结果显示，SIRT1抑制剂Sirtinol降低了Tan ⅡA对HG刺激的足细胞凋亡和氧化应激的影响，证实Tan ⅡA可能通过激活SIRT1/eNOS通路对HG诱导的足细胞损伤发挥保护作用。