王芳芳，曹慧媛，汪 婧，王 宁，黄国良

广东医科大学中美肿瘤所 东莞市表观遗传学重点实验室 广东医科大学附属东莞第一医院广东省医学分子诊断重点实验室，广东 东莞 523808

结直肠癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，全球范围来看结直肠癌(colorectal cancer, CRC)的发病率和病死率呈逐年上升趋势[1]，在中国，结直肠癌的发病率和病死率在所有癌中分别位居第3位和第5位[2]，严重威胁中国人民的身体健康以及国民经济的发展。因此，迫切需要进一步研究结直肠癌发生发展的分子机制，寻找结直肠癌新的诊断和治疗靶点。

MicroRNAs(miRNAs)是19～25 nt的短RNA分子, 可调节靶基因的转录后表达[3]。miRNA是基因表达的关键调节因子，在生物标志物的开发中具有前景。目前，处于临床前开发阶段的miRNA模拟物(mimic)和miRNA抑制剂(inhibitor)有望成为新的治疗药物[4]。miR-200家族是miRNA家族之一，由miR-141/200a/200b/200c/429组成，参与调控细胞转化、增殖和耐药性等许多重要的生物学过程[5-6]。本研究通过瞬时转染miRNA模拟物和miRNA抑制剂观察高低表达miR-200c-5p对人结直肠癌细胞系SW480增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人结肠癌细胞系SW480(上海盖宁生物公司)；胎牛血清、RPMI-1640培养基(Gibco公司)；含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化液(吉诺生物公司)；RT-qPCR主要试剂：RNA-easy(南京诺唯赞公司)；TB GREEN MIX、逆转录试剂盒(TaKaRa公司)；CCK8试剂(ZETA公司)；miR-200c-5p引物、U6引物、miR-200c-5p模拟物/抑制剂及阴性对照物(广州锐博生物公司)；Lipofectamine 3000(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分组及转染: SW480在含有10%胎牛血清(FBS)的1640培养基中保存。细胞系置于5% CO2培养箱，保持在37 ℃环境下培养。选择对数增殖期的细胞接种于6孔细胞培养板，当细胞贴壁汇合度达70%时，按照制造商的说明使用Lipofectamine 3000进行转染，培养箱中放置48 h后取出收集样品用于后续实验转染miRNA模拟物和抑制剂。

1.2.2 RT-qPCR检测miR-200c-5p的表达: 采用RNA-easy法提取转染48 h后的各组细胞中的总RNA，按照反转录试剂盒的说明反转录总RNA为cDNA，每组取等量cDNA进行qPCR扩增。以U6为内参分析miR-200c-5p的表达，采用2-△△Ct计算目的基因相对表达量。

1.2.3 CCK-8法检测SW480细胞活力: 将转染48 h后的各组SW480细胞按照每孔2 000个接种于96孔板，分别在培养1、2、3、4 d时，每孔加100 μL的CCK-8试剂稀释液，培养箱中继续培养4 h，利用酶标仪测定各孔在450 nm波长处的吸光度(A)值，反映各孔细胞的活力。

1.2.4 平板克隆实验检测细胞克隆形成能力:将各组SW480细胞以100个/孔接种于6孔板，置于37 ℃培养箱孵育12～15 d直到出现细胞集落。弃去细胞培养液，磷酸盐缓冲液洗涤2次，用4%多聚甲醛固定后，用1%结晶紫染色20 min。

1.2.5 生物信息方法分析miR-200c-5p的靶基因及其在结直肠癌中的差异表达:本研究使用R软件multiMiR统计分析经过实验验证的miR-200c-5p的靶基因，从TCGA数据库下载结直肠癌的基因表达和临床数据，利用limma和ggplot2软件对靶基因进行差异分析和可视化；使用enrichment plot软件对差异基因进行富集分析以进一步揭示miR-200c-5p可能与之相关的潜在生物途径。

1.3 统计学分析

数据采用GraphPad Prism9.0软件进行统计分析，所有比较均为双侧。

2 结果

2.1 瞬时转染细胞后miR-200c-5p的表达水平

转染模拟物组的miR-200c-5p水平显著高于对照组，转染抑制剂组的miR-200c-5p水平显著低于对照组(P<0.05)(图1A)。由此可见，瞬时转染模拟物/抑制剂可以成功高表达/低表达miR-200c-5p。

2.2 高表达/低表达miR-200c-5p对SW480细胞增殖活力的影响

高表达miR-200c-5p组的SW480细胞增殖活力明显低于对照组，低表达miR-200c-5p组的SW480细胞增殖活力明显高于对照组(P<0.05)(图1B～C)。

2.3 高表达/低表达miR-200c-5p对SW480细胞克隆形成的影响

与对照组相比，miR-200c-5p模拟物组细胞克隆数显著降低，miR-200c-5p抑制剂组细胞克隆数显著增加(P<0.05)(图2)。

2.4 miR-200c-5p靶基因及其在结直肠癌中的差异表达

生物信息分析结果显示，miR-200c-5p经过验证的靶基因有67个，其中在结直肠癌中有1个基因表达上调，3个基因表达下调，显著上调的基因为CXCL10，显著下调的3个基因为C2orf72、ZC3H12C和DST。KEGG富集分析结果显示变化最显著的3条相关通路为“melanoma”、 “microRNAs in cancer”和“bladder cancer”(图3)。

A.expression of miR-200c-5p in SW480 cells after transient transfection with mimic/inhibitor; B.detection of the proliferation activity of SW480 cells with high expression of miR-200c-5p; C.detection of the proliferation activity of SW480 cells with low expression of miR-200c-5p; *P<0.05 compared with normal control group

*P<0.05 compared with normal control group图2 miR-200c-5p对SW480细胞克隆形成能力的影响Fig 2 Effect of miR-200c-5p on clonogenic ability of SW480 cells

3 讨论

结直肠癌是临床上消化系统常见的恶性肿瘤之一，在全球呈快速上升趋势，是中国癌死亡相关的第五大原因[2]。已有研究证明，转移和复发是结直肠癌相关死亡的主要原因。因此对结直肠癌细胞增殖的分子机制的研究是有必要的。本研究的结果为miR-200c-5p在结直肠癌增殖及克隆形成中发挥关键作用提供了确凿证据。高水平表达miR-200c-5p可以抑制结直肠癌细胞的增殖及克隆形成，低水平表达miR-200c-5p可以促进结直肠癌细胞的增殖及克隆形成。本研究提示miR-200c-5p是一种很有前途的结直肠癌治疗靶点。

MicroRNAs是生物过程中的关键调控因子。人类基因组中存在超过两千个不同的miRNA，它们控制着大部分转录组，大多数miRNA通过失活或诱导mRNA降解来阻止翻译，进行转录后基因调控[7]。已有大量研究证明miR-200能够调节上皮细胞向间充质细胞转化(EMT)，是肿瘤转化的基础[8]。

本研究通过生物信息方法统计经过实验验证的 miR-200c-5p的靶基因，发现靶基因CXCL10在结直肠癌中的表达显著上调，C2orf72、ZC3H12C和DST在结直肠癌中显著下调。CXCL10是一种关键的驱动趋化因子，可以在癌和炎性反应自身免疫中指导CD4+和CD8+T细胞迁移特性[9]。C2orf72参与前列腺癌的发生发展[10]；ZC3H12C能够抑制内皮细胞的炎性反应，过表达Zc3h12c可降低TNFα(肿瘤坏死因子α)诱导的趋化因子和黏附分子的表达，从而降低单核细胞对HUVECs(人脐静脉内皮细胞)的黏附[11]。DST与多个免疫检查点和趋化因子相关，可能通过影响免疫微环境来改变肿瘤的发生发展[12]。KEGG富集分析结果显示miR-200c-5p可能在结直肠癌中参与“melanoma”、 “microRNAs in cancer”和“bladder cancer”。癌症中的microRNAs通路与包括结直肠癌在内的9种癌的发展相关;黑色素瘤和膀胱癌通路分别与黑素瘤和膀胱癌的发生发展密切相关。总之，本研究发现表明miR-200c-5p在结直肠癌细胞的增殖进展中起到重要作用，miR-200c-5p可能成为结直肠癌诊断和治疗的具有前景的生物标志物。

A.volplot shows the differential expression of miR-200c-5p target genes in human colorectal cancer; B.KEGG enrichment analysis shows the related pathways of miR-200c-5p involved in the development of human colorectal cancer