曹宁，王文涛

1.延安大学附属医院东关心脑血管专科病区神经外科，陕西 延安 716000；2.西北大学附属医院·西安市第三医院神经外科，陕西 西安 710021

神经母细胞瘤(neuroblastoma，NB)发病率高，占儿童癌症死亡率的15%，大多数儿童在诊断时已有转移，且具有异质性高、恶性程度高、生长迅速等特点，五年存活率不高，因此探索NB的干预方法，可提高患者生存率与生活质量[1-2]。细胞迁移和侵袭行为是影响肿瘤转移的重要因素，抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭对抑制肿瘤转移有重要作用。微小RNA(MicroRNA，miRNA)是内源性非编码小RNA，通过调节靶miRNA表达调控基因表达，在多肿瘤细胞增殖、转移和侵袭过程中发挥作用，参与疾病发展进程[3]。研究表明，多种miRNA在NB细胞的增殖迁移和侵袭中发挥重要作用，miR-340为一种肿瘤抑制基因，可调控多种肿瘤细胞的增殖、迁移等[4]。Wang等[5]研究发现，miR-340在肝癌组织和人肝癌细胞系中显著降低，miR-340可降低肝癌细胞系的细胞增殖并诱导细胞凋亡，然而miR-340对神经母细胞瘤的作用尚不清楚。S期激酶相关蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2，SKP2)可特异性识别磷酸化的细胞周期调节剂蛋白，参与细胞周期的调节，研究表明上调SKP2的表达，促进NB细胞增殖，并且SKP2是NB潜在的治疗靶点[6]。研究显示，MiR-339可靶向SKP2抑制肺癌系细胞增殖，而miR-340对SKP2是否有作用尚不明确[7]。因此，本研究旨在探索miR-340对细胞系神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)增殖、迁移及SKP2的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料来源 人神经母细胞瘤组织及癌旁组织标本来源于2018年10月至2020年12月在延安大学附属医院进行手术治疗的23例患者，手术前未经放化疗治疗，标本保存于-80℃保存。本研究所有患者知情并同意，经本院伦理委员会批准。人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)购于中国科学院细胞库；miR-340mimics、miR-340 NC、SKP2过表达质粒(SKP2)及空载质粒pcDNA、逆转录试剂盒、Lipofectamine 2000购自大连TaKaRa公司；miR-340、SKP2、U6、GADPH引物序列购自上海生工生物工程有限公司；RPMI 1640培养基购于北京Solarbio公司；双荧光素酶检测试剂盒购自美国Promega公司；RIPA裂解液、BCA试剂盒、ECL试剂购自Beyotime生物科技公司；兔抗人MMP9、MMP2单克隆抗体Abcam公司，小鼠抗人SKP2、β-actin单克隆抗体购自Proteintech公司，山羊抗兔lgG和山羊抗小鼠lgG购于美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 主要仪器 MiniAmp PCR仪购自美国ABI公司，MA100N型倒置显微购自日本Nikon公司，二氧化碳培养箱、Varioskan LUX多功能酶标仪购自美国ThermoFisher公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 SH-SY5Y与HUVEC在RPMI 1640培养基中进行传代培养，每隔两天换液，培养至3～5代后，取对数生长期细胞进行后续实验。

1.3.2 细胞转染 将SH-SY5Y细胞接种于6孔板中，待融合至80%左右，按照Lipofectamine2000说明书进行质粒转染，将细胞分为对照组、miR-340过表达(miR-340 mimics)组、miR-340阴性对照组(negative control，NC)组、miR-340 mimics+pcDNA组及miR-340mimics+SKP2组，对照组不做转染处理，其中miR-340 mimics与NC使用浓度为50 nmol/L，SKP2过表达质粒(SKP2)及空载质粒pcDNA使用浓度为20 nmol/L，转染后继续培养24 h。

1.3.3 实时荧光定量(Real-time quantification PCR，RT-qPCR)实验检测miR-340和SKP2 mRNA水平 采用RT-qPCR法检测miR-340和SKP2 mRNA相对表达量，根据RNA提取试剂盒，提取总RNA，合成cDNA后，进行PCR扩增。采用2-△△Ct法分别计算miR-340和SKP2 mRNA相对表达量。引物见表1。

表1 引物Table 1 Primers

1.3.4 细胞增殖实验 通过CCK-8法检测1.2.2各组SH-SY5Y细胞增殖情况，按照试剂盒说明书进行操作并计算细胞存活率。

1.3.5 细胞迁移实验 将各组SH-SY5Y细胞接种于6孔板，待各组SH-SY5Y细胞长满80%后，弃去培养液，用200μL移液器在6孔板中垂直划痕，记录划痕初始状态，加入培养基培养24 h，显微镜观察并计算迁移率。

1.3.6 Transwell小室检测细胞侵袭 Transwell小室上室铺好基质胶以后，每个小室接种200μL各组转染后的细胞悬液，下室加入完全培养液，继续培养48 h后，10%甲醛固定，0.5%结晶紫染色，随机选择6个视野显微镜观察并拍照，计算平均侵袭细胞数。

1.3.7 WB检测SKP2、MMP-2、MMP-9蛋白表达 收集1.2.2各组SH-SY5Y细胞，加入2 mL RIPA细胞裂解液收集总蛋白，电泳后转膜置0.45μm PVDF膜上，加入一抗SKP2、MMP-2、MMP-9和β-actin(按说明书进行稀释)，孵育过夜，加入二抗(1∶2 000)，室温孵育1 h，ECL试剂显色，分析条带实验结果。

1.3.8 双荧光素酶报告基因检测实验 根据基因预测软件，SKP2是miR-340的靶基因，根据miR-340结合SKP2-3'UTR序列区域，构建野生型SKP2-3'UTR-WT和突变型SKP2-3'UTR-MUT质粒，分别与miR-340 NC、miR-340 mimics共转染SH-SY5Y细胞24 h，裂解细胞，检测各组荧光素酶活性。

1.4 统计学方法 应用SPSS22.0统计学软件进行数据统计分析。计量资料符合正态分布，以均数±标准差(±s)表示，两组间数据比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NB组织中miR-340和SKP2 mRNA的表达水平比较 与瘤旁组织比较，神经母细胞瘤组织中miR-340表达水平降低，SKP2 mRNA表达水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 神经母细胞瘤组织和瘤旁组织的miR-340和SKP2表达水平比较(±s)Table 2 Comparison of miR-340 and SKP2 expression levels in neuroblastoma tissues and adjacent tissues(±s)

表2 神经母细胞瘤组织和瘤旁组织的miR-340和SKP2表达水平比较(±s)Table 2 Comparison of miR-340 and SKP2 expression levels in neuroblastoma tissues and adjacent tissues(±s)

组别瘤旁组织神经母细胞瘤组织t值P值miR-340 1.05±0.15 0.55±0.08 14.105 0.001 SKP2 mRNA 1.01±0.11 1.96±0.20 19.960 0.001

2.2 各组细胞miR-340、SKP2 mRNA及蛋白表达水平比较 与对照组和miR-340 NC组比较，miR-340 mimics组细胞miR-340表达水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，表明转染成功；与miR-340 mimics组和miR-340 mimics+pcDNA组比较，miR-340 mimics+SKP2组SKP2 mRNA及蛋白表达水平明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，提示过表达SKP2可逆转miR-340对SKP2的抑制作用，见图1。

2.3 双荧光素酶报告基因检测系统验证miR-340与SKP2靶向关系 经TargetScan Human数据库预测显示，miR-340与SKP2 mRNA 3'UTR区有结合位点，见图2。双荧光素酶报告基因检测结果显示，与SKP2-3'UTR-WT+miR-340 NC组比较，SKP2-3'UTR-WT+miR-340 mimics组荧光素酶活性降低(P<0.05)，证明miR-340与SKP2存在靶向关系，见图3。

图2 miR-340与SKP2 mRNA结合位点预测Figure2 Prediction of miR-340 and SKP2 mRNA binding sites

图3 双荧光素酶报告实验Figure3 Dual-luciferasereporter assay

2.4 miR-340 mimics转染对SH-SY5Y细胞存活率的影响 与对照组和miR-340 NC组比较，miR-340 mimics组SH-SY5Y细胞存活率明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，表明过表达miR-340明显抑制SH-SY5Y细胞增殖；与miR-340 mimics+pcDNA组比较，miR-340 mimics+SKP2组细胞存活率明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，提示过表达SKP2可逆转过表达miR-340对细胞的增殖抑制作用，见图4。

图4 各组细胞存活率Figure4 Cell survival rateof each group

2.5 各组SH-SY5Y细胞迁移能力比较 与对照组和miR-340 NC组比较，miR-340 mimics组细胞迁移率明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，提示过表达miR-340明显抑制SH-SY5Y细胞迁移；与miR-340mimics+pcDNA组比较，miR-340 mimics+SKP2组细胞迁移率明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，提示过表达SKP2可逆转过表达miR-340对细胞的迁移抑制作用，见图5。

图5 各组细胞迁移率Figure 5 Cell migration rateof each group

2.6 各组SH-SY5Y细胞侵袭能力比较 与对照组和miR-340 NC组比较，miR-340 mimics组SH-SY5Y细胞侵袭数目明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，提示过表达miR-340明显抑制SH-SY5Y细胞迁移；与miR-340 mimics+pcDNA组比较，miR-340mimics+SKP2组细胞侵袭数目明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，提示过表达SKP2可逆转过表达miR-340对细胞的侵袭抑制作用，见图6、图7。

图6 各组细胞侵袭图片(100μm，×200)Figure6 Picturesof cell invasion in each group(100μm,×200)

图7 各组细胞侵袭数Figure7 Number of cell invasionsin each group

2.7各组SH-SY5Y细胞MMP-2、MMP-9蛋白表达比较 与对照组和miR-340 NC组比较，miR-340mimics组SH-SY5Y细胞中MMP-2、MMP-9蛋白表达量明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与miR-340 mimics+pcDNA组比较，miR-340 mimics+SKP2组细胞MMP-2、MMP-9蛋白表达明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，进一步提示过表达SKP2可逆转过表达miR-340对细胞的迁移、侵袭抑制作用，见图8。

图8 各组细胞MMP-2、MMP-9蛋白表达情况Figure8 Expression of MMP-2and MMP-9protein in cellsof each group

3 讨论

NB是儿童常见的外周神经系统恶性肿瘤，约70%患儿确诊时已进展到肿瘤转移阶段。目前常用的手术、放疗、化疗等，但该肿瘤极易复发，预后差，严重威胁儿童生命健康[8-9]，因此研究肿瘤细胞增殖、迁移的分子机制，对于治疗方法选择及改善患者预后有重要意义[10]。

miRNAs可通过结合靶基因调控肿瘤细胞增殖与迁移，与多种肿瘤形成和发展有关。已有报道显示，miR-340在多种肿瘤组织与细胞中异常表达[11]。王妹兴等[12]研究表明结肠癌组织中miR-340表达水平低于癌旁组织，且miR-340表达与肿瘤直径、脉管侵犯、Ducks分期、临床分期、淋巴结转移和患者预后有关。Das等[13]研究表明，miR-340在NB中下调表达，其异常表达在NB中发挥重要作用。本研究通过RT-qPCR检测瘤旁组织NB组织中miR-340表达，结果显示，NB组织中miR-340表达水平降低，与Das等[13]报道一致。有研究表明，miR-340在鳞状细胞癌(SCC)组织及细胞中明显低表达，抑制miR-340可促进SCC细胞的增殖、迁移和侵袭[14]。另有研究显示，miR-340-5p在喉癌组织及细胞中异常低表达，转染miR-340-5p模拟物可明显抑制细胞体外增殖并诱导其凋亡[15]。miR-340对SH-SY5Y细胞的影响还未见报道，本研究将miR-340 mimics转染SH-SY5Y细胞后，结果显示，miR-340表达水平升高，提示转染成功，本研究还发现，过表达miR-340可显著抑制SH-SY5Y细胞增殖、迁移与侵袭能力，提示miR-340通过影响SH-SY5Y细胞增殖活性、迁移及侵袭行为参与NB的发生发展，发挥抑癌基因的作用，然而miR-340在SH-SY5Y细胞的具体作用机制尚不清楚。

miRNA通过调控靶基因而影响机体生物学功能，本研究经TargetScan Human数据库分析显示，miR-340与SKP2有靶向结合位点，且双荧光素酶基因检测报告显示，miR-340与SKP2存在靶向关系。SKP2基因被认为是一种原癌基因和细胞周期调节剂，SKP2可通过降解细胞球蛋白(Cygb)促进肿瘤细胞增殖，从而促进肿瘤的发生、发展[16]。SKP2在甲状腺癌、乳腺癌中均上调表达，发挥促癌的作用[17-18]。Li等[19]研究表明，SKP2显著促进程序性细胞死亡蛋白4(PDCD4)磷酸化、泛素化和降解，SKP2通过抑制PDCD4促进乳腺癌细胞增殖，抑制细胞凋亡并增强对DNA损伤的反应。He等[20]研究表明，miR-186通过靶向SKP2抑制食管鳞状细胞癌细胞的增殖，诱导细胞凋亡。本研究在SH-SY5Y细胞中过表达miR-340可明显降低SKP2 mRNA及蛋白表达水平，表明miR-340可能通过下调SKP2表达发挥抗癌作用，而过表达SKP2可逆转过表达miR-340对细胞的增殖、迁移与侵袭的抑制作用，提示SKP2发挥促癌基因的作用，与在其他肿瘤中报道类似。因此，miR-340可能通过靶向调控SKP2表达参与NB的发生发展。本研究只选择一种细胞系对miR-340的调控机制进行研究，其具体作用机制将选择多种细胞系或结合动物模型做更深入研究。

综上所述，神经母细胞瘤中miR-340低表达，过表达miR-340可通过靶向下调SKP2表达，抑制SH-SY5Y细胞增殖、迁移与侵袭，为NB的分子靶向治疗提供一种思路。