滕元姬，凌永嫦, 王俊利

(1.右江民族医学院附属医院a.检验科，b.产科，广西百色533000；2.右江民族医学院医学检验学院，广西百色533000)

SMAD4 (sma mothers against decapentaplegia homologue 4)，又名DPC4(deleted in pancreatic cancer, locus 4)，位于人类染色体18q21.1，是信号转导蛋白SMADs家族成员。SMADs家族分为三类：R-SMAD (SMAD1、2、3、5、8)、co-SMAD4、I-SMAD (SMAD6、7)，其中以co-SMAD4最常见[1]。SMAD4是转化生长因子-β(TGF-β)转录反应的重要细胞内递质[2]。起始于转化生长因子-β的众多分泌因子几乎控制着成年人的每一个发育过程和动态平衡，TGF-β信号的紊乱与许多发育障碍和癌症等复杂疾病关系密切[3]。SMAD4在TGF-β信号通路上起着稳定SMADs-DNA结合复合体，招募转录激活因子等重要作用，因此，SMAD4基因的突变或缺失被认为是多种癌症发生的基础[4]。本研究旨在探讨SMAD4基因在广西壮族女性人群中的携带和突变频率，为相关易感性疾病的研究提供理论基础。

1 对象与方法

1.1 研究对象收集2018—2019年在右江民族医学院附属医院体检的233名壮族女性全血样本，平均年龄(45.98±10.12)岁。经问卷调查，所研究对象籍贯和长期居住地都是广西地区，个体间无亲缘关系，各项体检实验室指标均在正常范围，既往无慢性病史、自身免疫类疾病史、精神病史。所有研究对象均签署知情同意书，此项研究经右江民族医学院附属医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取收集受试者经EDTA-K2+抗凝的全血样本2～3 mL。 DNA提取试剂盒为深圳亚能生物科技有限公司生产，所有实验操作严格按照实验规范和使用说明书进行，所提取的DNA-80 ℃条件保存备用。

1.2.2 PCR引物设计及反应体系Primer 5.0软件设计SAMD4位点扩增引物，由上海天昊生物科技有限公司合成。PCR反应体系(20 μL)含1x GC-I buffer(Takara)， 2 U 3.0 mM Mg2+，0.3 mM dNTP, 1 U HotStar Taq polymerase (Qiagen Inc.)，1 μL样本DNA和1 μL多重PCR引物。PCR循环程序：1 step 95 ℃ 2 min，2 step 11个循环(94 ℃ 20 s，65 ℃ 40 s，72 ℃ 1.5 min)，3 step 24循环(94 ℃ 20 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min)，4 step 72 ℃ 2 min，4 ℃ forever。多重PCR产物纯化：在20 μL PCR产物中加入5 U SAP酶和2 U Exonuclease Ⅰ酶，37 ℃水浴1小时，75 ℃ 灭活15 min。连接反应体系：10x连接缓冲液 1 μL、高温连接酶0.25 μL、5'连接引物混合液(1 μM)0.4 μL，3'连接引物混合液(2 μM)0.4 μL、纯化后多重PCR产物2 μL、ddH2O 6 μL 混匀，连接程序38个循环(94 ℃ 1 min，56 ℃ 4 min)。

1.2.3 SNPs分型IMLDRTM多重SNP分型试剂盒(上海天昊)，rs3819122和rs34468925位点所在区段采用多重PCR反应在一个体系中获得扩增。扩增产物经外切核酸酶/虾碱酶(EXOI/SAP)纯化后用于后续连接酶反应的模板。每个位点包含两个5'端等位基因特异探针和一条3'端位点的荧光标记的特异探针。连接产物通过ABI3730XL毛细管电泳来区分(DNA测序及引物信息见表1)。

表1 rs3819122和rs34468925信息及PCR引物

1.3 其他种族人群信息通过ENSEMBL数据库(千人基因组数据)获取北京汉族、中国南方汉族、非洲、美国、日本、欧洲、南亚女性人群rs3819122和rs34468925位点基因型和等位基因数据。

1.4 统计学方法实验数据分析运用统计软件SPSS 24.0分析。用χ2检验比较rs3819122和rs34468925位点基因型、等位基因组间分布频率，用Hardy-Weinberg 遗传平衡定律验证各群体遗传平衡水平，检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 基因型分析SMAD4基因 rs3819122和 rs34468925 SNPs 分型显示：rs3819122位点有AA、CA和CC基因型，rs34468925位点有CC、CT和TT基因型(见图1)。

A为rs34468925位点CC、CT和TT基因型；B为rs3819122位点AA、CA和CC基因型

2.2 rs3819122和rs34468925 SNPs 在广西壮族女性人群中的分布SMAD4基因rs3819122和 rs34468925位点基因型和等位基因在广西壮族女性人群中的分布频率如表2所示，rs3819122位点基因型以CA为主(43.8%)，其次是AA和CC(36.9%和19.3%)，A等位基因占58.8%。rs34468925位点基因型以CT为主(43.8%)，其次是CC和TT(42.9%和13.3%)，C等位基因占64.8%。用群体遗传学Hardy-Weinberg平衡定律检验基因型频数，rs3819122(P=0.140)和 rs34468925(P=0.538)均符合H-W平衡定律(P>0.05)，结果表明群体基因遗传平衡，所收集样本来自同一孟德尔群体。见表2。

表2 rs3819122和 rs34468925 SNPs 在广西壮族女性人群中的分布[n(%)]

2.3 rs3819122和rs34468925 SNPs在其他人群中的分布从ENSEMBL数据库中提取并筛选出具有区域代表性的(北京汉族、中国南方汉族、非洲、美国、日本、欧洲、南亚)女性人群SMAD4基因 rs3819122和 rs34468925位点的基因型和等位基因，并与广西壮族女性人群进行比对，结果显示：广西壮族女性人群rs3819122基因型与日本和南亚女性人群相比分布差异有统计学意义(χ2=8.275，P=0.016和χ2=23.907，P<0.001)，与北京汉族、中国南方汉族、非洲、美国、欧洲女性人群相比分布差异无统计学意义(P>0.05)；等位基因与南亚人群相比差异有统计学意义(χ2=25.752，P<0.001)。rs34468925基因型与非洲和南亚女性相比分布差异有统计学意义(χ2=16.742，P<0.001和χ2=10.983，P=0.004)，与北京汉族、中国南方汉族、美国、日本、欧洲女性人群相比差异无统计学意义；等位基因与北京汉族、非洲和南亚女性人群相比分布差异有统计学意义(χ2=4.389，P=0.036、χ2=16.539，P<0.001和χ2=11.255，P=0.001)。见表3、表4。

表3 rs3819122在不同女性人群中的分布[n(%)]

表4 rs34468925在不同女性人群中的分布[n(%)]

3 讨 论

20世纪90年代，SMADs首次被发现是TGF-β转录反应的关键细胞内介质，它们从TGF-β通路中将信号直接传递到细胞核，并在细胞核介导转录反应。这一过程起始于R-SMAD磷酸化的驱动，并与co-SMAD4 和I-SMAD相互作用形成SMADs-DNA-复合体进行信号传递，目前被研究最多的是磷酸化的R-SMADs与SMAD4之间形成的复合体[5-6]。研究认为，SMAD4对TGF-β通路的信号转导不是必需的，但它在SMADs-DNA复合体中起着关键的稳定性作用，对信号具有最高的应答反应，并通过招募转录激活因子共同作用于转录反应[7]。SMAD4高亲和力和高特异性的DNA结合活性，使它能够将各种转录因子的错综复杂的蛋白质-蛋白质相互作用引导到各自正确的调控元件上[8-9]。因此，SMAD4基因的缺失或突变被认为是肿瘤细胞对TGF-β产生抵抗的基础[10]。

本研究发现，广西壮族健康女性人群中SMAD4基因rs3819122位点以CA基因型为主，与日本和南亚女性人群的分布频率差异有统计学意义。rs3819122以A等位基因为主，且与南亚女性人群分布差异有统计学意义。而rs34468925位点的基因型以CT为主，与非洲和南亚女性人群分布频率相比，差异有统计学意义。rs34468925以C等位基因为主，与北京汉族、非洲、南亚女性人群的分布差异有统计学意义。可见，本次研究的SMAD4基因rs3819122和 rs34468925位点不仅在广西壮族女性人群中存在遗传多态性，且与其他种族人群相比具有SNPs差异性。

MAROUF等[11]对摩洛哥人群中APOBEC3和DRIVER基因功能与乳腺癌发病风险相关性的研究发现，SMAD4 rs3819122与乳腺癌肿瘤大小有相关性。王佩[12]的研究发现，SMAD4 rs3819122 SNPs和环境之间的交互作用与强迫症的严重程度相关，并可能成为预测强迫症严重程度的一个指标。SMAD4被认为是胰腺导管腺癌(PDAC)中最常见的基因改变之一，研究发现SMAD4在50%～55%的PDAC中特异性失活，且与PDAC较低的总体生存率、肿瘤转移相关[13]。研究表明SMAD4在95.8%的妇科原发肿瘤中有保留表达以及在鳞状细胞癌(SCCs)中常见缺失[4,14]。另外，SMAD4基因在T细胞中调节细胞的存活、增殖、分化和生长，T细胞中SMAD4基因的缺失或突变往往会导致种类免疫性疾病[15]。因此，SMAD4基因无论是在TGF-β通路中的重要作用，还是自身高度遗传多态性，它的突变或缺失都会对疾病发生发展产生重要影响。

广西地处西南边陲，毗邻东南亚多个国家，是以壮族为主的多个少数民族聚居区，与北京、江浙等中国经济较发达地区相比，经济、交通发展相对落后，人员流动性少，居住地相对固定，是多种遗传性疾病的高发地区，如地中海贫血、G6PD缺乏症、鼻咽癌、肝癌等。本次研究主要是探讨SMAD4在广西壮族女性人群中的携带和突变频率，同时了解该基因在其他人群的分布情况，为后续相关易感性疾病(如宫颈癌、乳腺癌等)的研究提供理论基础。本研究也存在不足之处，如研究例数较少，研究种族单一，只针对壮族女性人群，未将其他少数民族人群纳入其中。因此，从更多元、更深层次去研究SMAD4基因与易感疾病相关性，是未来研究的方向，力争为相关易感性疾病提供更多理论支持。