马彦娥，符号，郝光军，李婷

榆林市第一医院肿瘤诊疗中心，陕西 榆林 719000

肺癌患病人数多，以非小细胞肺癌为主，约占所有新发癌症的13%。多数患者在首次诊断时，常因病情严重(中晚期)而失去外科手术的最佳机会，其5年生存率低[1]。目前，抗肿瘤药物治疗是延长中晚期患者生命的主要方法。靶向治疗是在细胞分子水平上，针对已经明确的致癌位点的治疗方式。在非小细胞肺癌中，表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是常见的驱动基因，其突变率高达60%[2]。临床常使用EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs)对此类患者进行靶向治疗，而获得性耐药是影响疗效的关键因素，因此，探讨与EGFR-TKIs耐药相关的辅助指标对疗效的改善有积极意义[3]。微小RNA(microRNA，miRNA)参与多种疾病的病理过程，其中微小RNA-532-3p(microRNA-532-5p，miR-532-3p)在肿瘤中起到了重要作用[4]。而有丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein-kinase，MAPK)级联是调节增殖和应激反应等多种细胞过程的关键信号通路，在肿瘤血管生成中也具有重要作用[5]。但miR-532-3p、MAPK在非小细胞肺癌中的表达及其与患者靶向治疗耐药的相关性尚有待验证。本研究通过检测非小细胞肺癌患者的血清miR-532-3p、MAPK水平，分析两者与化疗有效率及患者5年生存期的关系，旨在为靶向治疗药物的选择提供帮助。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2013年6月至2016年1月期间榆林市第一医院肿瘤诊疗中心收治的30例EGFR基因突变非小细胞肺癌患者作为耐药组，均为EGFR-TKIs耐药患者，其中临床分期Ⅲ期15例、Ⅳ期15例。EGFR-TKIs耐药均为获得性耐药，即EGFR-TKIs治疗有临床获益，但之后出现肿瘤进展。耐药组纳入标准：(1)病理结果显示为非小细胞肺癌；(2)DNA测序证实为EGFR基因突变；(3)无其他部位肿瘤；(4)首次治疗者。排除标准：(1)有远处转移者；(2)不能坚持服药者；(3)既往有肺部手术史者；(4)病情严重，且预计生存时间在1年内者。选取同期于榆林市第一医院肿瘤诊疗中心治疗的非小细胞肺癌EGFR-TKIs非耐药患者32例为非耐药组，其中临床分期Ⅲ期21例、Ⅳ期11例。非耐药组纳入标准：(1)病理结果显示为非小细胞肺癌；(2)无其他部位肿瘤；(3)首次治疗者。排除标准与耐药组一致。本研究经我院伦理委员会批准，所有患者均知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 药物服用方法患者接受一线标准治疗方案，包括埃克替尼、厄洛替尼、阿法替尼及吉非替尼，具体药物的选择依据患者病情进行评估。

1.2.2 血清标本采集于清晨利用采血管收集患者空腹外周静脉血，每例5 mL，在4℃、3 000 r/min的离心机中离心，离心时间为15 min，分离血清，用于检测血清miR-532-3p、MAPK水平。

1.2.3 血清miR-532-3p水平检测以实时荧光定量PCR法并按照试剂盒中的步骤检测血清miR-532-3p水平。使用Trizol试剂(货号：NR0002，北京雷根生物技术有限公司)从血清中抽提总RNA，合格标准为：吸光度A260/A280值在1.8~2.0之间，使用反转录试剂(货号：k1622，北京兰博康斯科技有限公司)将合格的总RNA反转录为cDNA。反应体系20μL，其中正向和反向引物各2μL、cDNA 2μL、PCRMix 10μL、补水至20μL。反应条件：95℃、10 min，95℃、15 s，72℃、15 s，共35个循环。通过比较Ct值并利用公式2-△△Ct计算miR-532-3p的相对表达量。引物序列见表1。

表1 PCR引物序列Table1 PCR primer sequence

1.2.4 血清MAPK水平检测采用酶联免疫吸附法检测MAPK水平，丝裂原激活的蛋白激酶/MAP激酶(MAPK)酶联免疫吸附法试剂盒(货号：ml122748，上海酶联生物)，严格按照试剂盒方法操作。

1.3 疗效评价标准[6]患者完全缓解(complete relief，CR)为治疗后靶病灶完全消失，持续≥4周无新发病灶；患者部分缓解(partial relief，PR)为靶病灶缩小≥50%，且持续≥4周并无新发病灶；患者进展(progressive disease，PD)为靶病灶增大≥25%或有新发病灶；患者稳定(stable disease，SD)介于PR及PD之间。其中有效为CR、PR、SD例数之和，无效为PD。

1.4 统计学方法应用SPSS25.0统计软件分析数据。计量资料符合正态分布，以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用独立样本t检验；计数资料比较采用χ2检验；采用Kaplan-Meier法分析血清miR-532-3p、MAPK表达水平与5年生存期的关系；非小细胞肺癌患者预后不良的影响因素以Cox回归模型进行分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者的一般资料比较两组患者的性别、年龄、吸烟史、肺癌类型、临床分期、分化程度及服药种类等一般资料比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表2和表3。

表2 两组患者的性别、年龄以及吸烟史比较[±s，例(%)]Table 2 Comparison of gender,age,smoking history between the two groupsof patients[±s，n(%)]

表2 两组患者的性别、年龄以及吸烟史比较[±s，例(%)]Table 2 Comparison of gender,age,smoking history between the two groupsof patients[±s，n(%)]

组别非耐药组耐药组χ2/t值P值例数32 30男15(46.88)14(46.67)女17(53.13)16(53.33)年龄(岁)60.45±5.46 60.26±5.17 0.140 0.889吸烟史10(31.25)13(43.33)0.969 0.325 0.000 0.987性别

表3 两组患者的肺癌类型、临床分期、分化程度及服药种类比较[±s，例(%)]Table3 Comparison of type of lung cancer,clinical stages,degree of differentiation,and type of medication between thetwo groups of patients[±s，n(%)]

表3 两组患者的肺癌类型、临床分期、分化程度及服药种类比较[±s，例(%)]Table3 Comparison of type of lung cancer,clinical stages,degree of differentiation,and type of medication between thetwo groups of patients[±s，n(%)]

腺癌15(46.88)14(46.67)0.023 0.989鳞癌10(31.25)9(30.00)腺鳞癌7(21.88)7(23.33)Ⅳ期11(34.38)15(50.00)1.552 0.213Ⅲ期21(65.63)15(50.00)高分化12(37.50)16(53.33)中低分化20(62.50)14(46.67)厄洛替尼6(18.75)8(26.67)阿法替尼7(21.88)5(16.67)吉非替尼9(28.13)6(20.00)埃克替尼10(31.25)11(36.67)1.203 0.752组别非耐药组耐药组χ2值P值例数32 30肺癌类型 临床分期 分化程度 服药种类1.567 0.211

2.2 两组患者的血清miR-532-3p、MAPK水平比较与非耐药组比较，耐药组患者的血清miR-532-3p水平明显升高，血清MAPK水平明显降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表4。

表4 两组患者的血清miR-532-3p、MAPK水平比较(±s)Table4 Comparison of serum miR-532-3p and MAPK levelsbetween thetwo groupsof patients(±s)

表4 两组患者的血清miR-532-3p、MAPK水平比较(±s)Table4 Comparison of serum miR-532-3p and MAPK levelsbetween thetwo groupsof patients(±s)

例数32 30组别非耐药组耐药组t值P值miR-532-3p 1.05±0.16 2.09±0.24 20.194 0.001 MAPK(mg/L)7.63±3.28 1.04±0.57 10.847 0.001

2.3 血清miR-532-3p、MAPK表达水平与化疗客观有效率的关系本研究以血清miR-532-3p水平(2.09)、MAPK水平(1.04)平均值为界，将患者分别分为miR-411-3p高、低表达组和MAPK高、低表达组。化疗3个周期(21 d为一个周期)后，miR-532-3p低表达患者治疗有效率高于miR-532-3p高表达患者，MAPK低表达患者治疗有效率低于MAPK高表达患者，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表5。

表5 血清miR-532-3p、MAPK表达水平与化疗客观有效率的关系(例)Table5 Relationship between theexpression levelsof serum miR-532-3p and MAPK and theobjectiveresponserateof chemotherapy(n)

2.4 血清miR-532-3p、MAPK表达水平与患者5年生存期的关系随访5年，非小细胞肺癌患者生存42例，死亡20例。Kaplan-Meier分析结果显示，血清miR-532-3p低表达患者5年累积生存率为84.4%，高于血清miR-532-3p高表达者的50.0%，差异有统计学意义(Log-rankχ2=9.772，P＜0.05)；血清MAPK低表达患者5年累积生存率为61.3%，低于血清MAPK高表达者的74.2%，但差异无统计学意义(Log-rankχ2=1.969，P＞0.05)，见图1、图2。

图1 血清miR-532-3p表达水平与患者5年生存期的关系Figure 1 Relationship between serum miR-532-3p expression and 5-year survival of patients

图2 血清MAPK表达水平与患者5年生存期的关系Figure 2 Relationship between serum MAPK expression and 5-year survival of patients

2.5 影响患者预后不良的因素由于耐药组患者的病例数较少，除本研究观察指标miR-532-3p、MAPK外，将临床高度关注的临床分期纳入Cox回归模型分析。结果显示，MAPK低表达、miR-532-3p高表达是非小细胞肺癌患者发生靶向治疗耐药的独立危险因素(P＜0.05)，见表6。

表6 Cox回归模型分析影响非小细胞肺癌患者预后不良的因素Table 6 Cox regression model analysisof factorsinfluencing poor prognosisof patientswith non-small cell lung cancer

3 讨论

肺癌患者由于早期出现的症状常不具有特异性，易错失手术机会，常需抗肿瘤药物治疗来延长生存时间。EGFR基因突变患者常用靶向药物(如埃克替尼、吉非替尼等)控制肿瘤的生长和扩散，获得更长的生存期。但治疗过程中产生的耐药性可影响药物发挥作用[7]。因此，寻找能早期反映靶向治疗耐药性的辅助指标，对治疗方案的选择及临床疗效的提高可能有帮助。

miR-532-3p已被证实在多种肿瘤中具有抑癌作用，且参与肿瘤耐药的发生。miR-532-3p通过3'端非翻译区的直接结合作用和对转录活性的间接抑制作用进行调控[8]。Wang等[9]报道显示，肝细胞癌组织中miR-532-3p的表达水平较高，miR-532-3p表达与肿瘤直径、血管侵犯及TNM分期有关。而陈新华等[10]研究显示，胃癌组织中miR-532-3p表达下调与肿瘤远处转移的发生有关，其表达变化与胃癌病情密切相关。本研究发现，与非耐药组血清miR-532-3p水平相比，耐药组血清miR-532-3p水平升高，miR-532-3p低表达患者治疗有效率高于miR-532-3p高表达患者，与Wang等[9]研究类似，提示miR-532-3p表达升高与EGFR-TKIs靶向治疗耐药有关，且miR-532-3p表达可作为评估患者化疗疗效的指标。本研究还发现，血清miR-532-3p低表达非小细胞肺癌患者具有更高的5年累积生存率，考虑可能与化疗3个周期后，血清miR-532-3p低表达患者治疗有效率较高有关。

MAPK级联是调节包括细胞增殖、分化和应激反应在内的基本过程的中心信号元件，可通过连续激活三到五层蛋白激酶来传递信号，MAPK通路在肿瘤生成及转移中具有重要作用[11]。有研究显示，MAPK通路参与调节肺癌、胃癌等癌症患者化疗药物的耐药性[12]。江雪莲等[13]研究报道，MAPK/ERK信号通路的活化形式与卵巢癌细胞的增殖及凋亡有关，抑制该信号通路对临床治疗卵巢癌有帮助。本研究中，EGFR-TKIs耐药患者血清MAPK水平显著低于EGFR-TKIs非耐药患者，且MAPK高表达者治疗有效率为70.97%，较MAPK低表达者高，提示MAPK表达降低可能参与耐药性的发生，且检测MAPK表达可能对评估患者化疗疗效有积极意义。本研究生存分析还发现，血清MAPK高表达非小细胞肺癌患者5年累积生存率虽高于血清MAPK低表达患者，但差异无统计学意义。今后需扩大研究对象继续探讨MAPK与患者长期预后的关系，以得到可靠结论。最后本研究多因素Cox回归模型分析显示，miR-532-3p高表达、MAPK低表达均与靶向治疗耐药的发生独立相关，提示miR-532-3p表达上调及MAPK表达下调可能促进患者发生靶向治疗耐药，但具体机制尚需补充相关实验进行验证。

综上所述，非小细胞肺癌患者血清miR-532-3p水平升高及MAPK水平降低与EGFR-TKIs耐药有一定关系，两者均可作为评估EGFR-TKIs耐药的血清指标，且与患者预后密切相关。