杜艳姣，李艳，段智慧，商丹丹

癫痫是神经内科最常见的疾病之一，但约1/3的患者为难治性癫痫，对抗癫痫药物反应不佳[1]，癫痫发作不能充分控制、治疗效果差，会导致严重的共病[2]，如认知障碍、精神障碍甚至猝死，给患者的生活和家庭、社会带来极坏的影响。大量的基础实验表明，炎症途径的激活可能是不同病因、不同类型的癫痫发作的共同因素[3-4]，细胞焦亡在炎症过程中起着重要的作用[5]。有研究发现，在癫痫发作时，NLRP3炎性小体参与了细胞焦亡的发生过程[5-6]，参与依赖Caspase-1的经典细胞焦亡途径，调节IL-1β和IL-18的表达。P2X7R是一种ATP门控阳离子非选择性通道受体[7]，在IL-1β的形成和释放中起重要作用，其作为脑组织炎症反应的重要靶点受到广泛的关注[8]。在多种癫痫模型中，如海马、杏仁核、梨状皮层及新皮层等边缘叶癫痫模型，P2X7R在癫痫发作的不同阶段均有表达的上调[9-13]，且P2X7R的激活可引起和加重炎症反应[14-15]。多项研究表明，在先天性髓样细胞(单核细胞、巨噬细胞及树突状细胞)中的炎症过程，P2X7R是NLRP3炎性小体的最有效的激活剂[16]。但在癫痫发作中，是否有P2X7R/NLRP3/Caspase-1信号通路的参与尚未可知，本研究通过对癫痫患者发作期(ES)和发作间期(EI)外周血中炎性介质的检测，证实这一假说，为难治性癫痫提供新的治疗靶点。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2021年7月至2022年4月在郑州大学附属洛阳中心医院就诊的难治性癫痫患者40例作为正常癫痫组；纳入同期的健康体检者40例作为正常对照组。

纳入标准：(1)癫痫组患者均符合2010国际抗癫痫联盟(ILAE)对于难治性癫痫的定义[17]，应用2种或2种以上的抗癫痫药物足量治疗，无发作时间<1年或3倍最长的发作间期；(2)年龄18～80岁；(3)就诊时发作频率至少每月发作≥4次；(4)癫痫病程≥2年；(5)配合完成研究者。排除标准：(1)合并急性感染，或患有心、肺、肝、肾及血液等全身系统疾病者；(2)患恶性肿瘤或精神障碍疾病者；(3)严重的肝肾功能损害者；(4)濒危患者。本研究获郑州大学附属洛阳中心医院伦理委员会批准，所有纳入者本人或家属均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 诊断及数据收集

由神经内科专科医生根据2017癫痫分类进行癫痫的诊断分类[18]，包括癫痫发作类型、病因分类及癫痫综合征等；对所有纳入者进行临床基本资料(年龄、性别、病程、发作类型、病因分类及抗癫痫用药等)的采集，留取血液标本，收集整理实验室数据。

1.2.2 方法

(1)抽取纳入者的空腹静脉血(约6 mL)，置于肝素抗凝的真空采血管中；(2)用密度梯度离心法分离收集外周血单个核细胞，应用流式细胞仪进行P2X7R表达的分析(Anti-P2X7R-FITC，Sigma)；(3)将外周血离心，取血浆在-20°C 冻存，备测。应用NLRP3 ELISA试剂盒(北京索莱宝公司)、Caspase-1 ELISA试剂盒(武汉华美公司)、IL-1β ELISA试剂盒(北京索莱宝公司)、IL-18 ELISA试剂盒(北京索莱宝公司)，检测血浆中的NLRP3、Caspase-1、IL-1β及IL-18的表达水平，试验过程严格按照试剂盒说明书进行操作；(4)检测外周血中的红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)和血清C-反应蛋白(C-reactive protein，CRP)水平。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 临床基本资料

癫痫组40例中男性27例(68%)、女性13例(32%)，平均病程(4.98±3.21)年，发作类型中局灶性起源19例(47%)、全面性起源13例(33%)、未知起源8例(20%)，病因分类中结构异常14例(35%)、感染性5例(13%)、免疫性6例(15%)、代谢性2例(5%)、遗传性1例(2%)、原因不明12例(30%)，40例癫痫患者抗癫痫药物(ASM)联合用药中2种28例(70%)、3种8例(20%)、4种4例(10%)，其中丙戊酸钠30例(75%)、拉莫三嗪23例(57%)、奥卡西平21例(52%)、左乙拉西坦14例(35%)、托吡酯3例(7%)、苯巴比妥2例(5%)、氯硝西泮2例(5%)、拉考沙胺1例(2%)；正常对照组40例中男性24例(60%)、女性16例(40%)，所有纳入者年龄18～72岁，癫痫组平均(47.10±17.83)岁，正常对照组平均(50.58±13.92)岁，癫痫组与对照组在性别及年龄等方面比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 两组患者在P2X7R、NLRP3 、Caspase-1及炎性因子表达水平之间的比较

癫痫组患者P2X7R、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18、ESR及CRP的表达均高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.001)，结果详见表1。应用ANVOA单因素方差分析显示，ES患者的外周血中P2X7R、NLRP3、Caspase-1及炎性因子(IL-1β、IL-18、ESR及CRP)的表达均高于EI患者及正常对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，且EI时P2X7R、NLRP3、Caspase-1及炎性相关指标(IL-1β、IL-18)在外周血中的表达仍高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，详见图1。

表1 正常对照组和癫痫组在炎性相关指标之间的比较

注：CON为正常对照组，EI为癫痫发作间期，ES为癫痫发作期，ESR为红细胞沉降率，CRP为C-反应蛋白；**P<0.01，***P<0.001。图1 癫痫组与正常对照组的炎症相关指标的表达情况图

3 讨论

本研究通过对真实世界中癫痫组患者EI、ES与正常对照组进行外周血检测，发现癫痫组患者P2X7R、NLRP3、Caspase-1及其释放的IL-1β、IL-18均较正常对照组有明显升高，提示癫痫发作可能激活P2X7R/NLRP3/Caspase-1炎性信号通路，导致癫痫组患者炎性指标较正常对照组明显升高，且这一信号通路的激活可延续到癫痫发作间期，这可能与癫痫复发有关。

有研究表明，自身免疫障碍是癫痫发作和诱因的关键因素[19]，例如Rusmussen脑炎及边缘叶脑炎等[20-21]，可引起癫痫持续状态和反复性难治性癫痫发作，且对于此类患者，免疫治疗较抗癫痫药物治疗更为有效[22]，Rusmussen脑炎患者手术病理也发现脑组织中小胶质细胞活化、反应性星型细胞增多及促炎性介质的生成[21]。与此同时，炎症也是非自身免疫性过程引起癫痫发病和加重的重要因素[19]，例如发热及感染往往会导致癫痫发作和病情加重。大量动物实验也表明，癫痫发作后，脑内胶质细胞被激活，释放炎性介质如IL-1β及HMGB1等，引发神经炎症，引起神经元细胞的过度兴奋、丢失，导致癫痫阈值的降低，出现癫痫发作，从而形成恶性循环[3]。

P2X7R是一种ATP门控阳离子非选择性通道受体，可由先天性和适应性免疫细胞表达，与胞外一定浓度的腺苷 5'-三磷酸 (Adenosine 5 ′-triphosphate,ATP)结合而被激活，诱发炎症反应[7,14,16]。ATP是所有活细胞的中心能量分子，也参与调节细胞增殖、分化及死亡等基本过程[16]，同时它还是一种损伤相关分子模式 (DAMP)，组织或器官损伤发生后，可导致ATP在局部的蓄积，激活P2X7R[15]。NLRP3炎性小体是由NOD样受体NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白及Pro-caspase-1在细胞内组成的大分子多蛋白复合物[23]，作为炎症反应平台参与依赖Caspase-1的经典细胞焦亡途径，一方面可诱导细胞膜穿孔，细胞破裂，释放内容物，引起细胞焦亡和炎症反应；另一方面，活化的Caspase-1对IL-1β和IL-18的前体进行切割，形成有活性的IL-1β和IL-18，释放到细胞外，募集炎症细胞聚集，扩大炎症反应[24]。

有研究显示，P2X7R是NLRP3的强烈激活剂[16]，具体机制为DAMP激活P2X7R后，导致离子通道开放，从而细胞内K+减少、Ca2+增加、ROS产生、线粒体去极化和溶酶体失稳；其中细胞内K+的流出是NLRP3激活的关键基本步骤之一。NLRP3炎性小体的激活，触发Caspase-1参与的细胞焦亡和炎性反应发生，导致炎性细胞因子释放[25]。本研究发现，癫痫患者ES时，P2X7R/ NLRP3/ Caspase-1信号通路被激活，发生级联反应，P2X7R/ NLRP3/ Caspase-1表达明显升高，导致IL-1β及IL-18等炎症细胞因子释放，表达量明显增加，募集炎症细胞聚集，扩大炎症反应，提高神经的兴奋性，降低癫痫发作的阈值。在癫痫患者EI时， P2X7R/ NLRP3/ Caspase-1通路的表达仍高于正常对照组，说明该通路在EI时仍有一定的激活，这也就解释了癫痫患者在易感因素刺激下出现癫痫复发的原因。

综上所述，本研究显示癫痫发生后，P2X7R/NLRP3/Caspase-1信号通路可能参与了癫痫发生发展过程中炎症相关的神经损伤，此可能为难治性癫痫的治疗提供新的靶点。