浙江凤阳山不同海拔常绿阔叶林土壤微生物特征

2022-12-07曹敏敏鲁建兵刘胜龙

浙江农林大学学报 2022年6期

何柳，曹敏敏，鲁建兵，郑翔，刘胜龙，姜姜

（1. 南京林业大学南方现代林业协同创新中心江苏省水土保持与生态修复重点实验室，江苏南京 210037；2. 凤阳山-百山祖国家级自然保护区凤阳山管理处，浙江龙泉 323700）

土壤微生物参与森林生态系统中很多生态过程[1]。土壤细菌群落是土壤养分循环的参与者，在有机质的矿化、无机元素的转化以及土壤碳氮的积累等过程中发挥着重要作用[2−5]；土壤真菌通过产生多种胞外酶，可以有效分解各类有机质，将死去的有机物转化为生物量、二氧化碳和有机酸，从而调节碳和养分的平衡[6−8]。

气候变暖以及氮沉降对土壤微生物群落的结构、多样性和丰富度有显著影响[9]。山地海拔梯度作为模拟气候变化的有效方法[10]，其特点是在较短的地理距离上发生巨大的生物与非生物变化[11]，例如温度和湿度等气候要素[1]，因此，海拔梯度可以探究土壤微生物群落对气候变化的响应[12]。研究表明：土壤微生物多样性随海拔的变化有多种模式，包括下降、增加、中海拔峰值和极端海拔峰值等[13−15]。这是由于影响微生物群落变化的因子多种多样。LOOBY等[13]在土壤微生物与海拔关系的研究综述中阐明：气候和土壤(尤其是pH)是驱动土壤微生物群落变化的主要机制。在对亚热带高山区域的研究中，赵盼盼等[16]研究表明：温度与可溶性有机氮(DON)对土壤微生物群落结构变化起主导作用；孟苗婧等[17]发现：土壤理化因子是海拔梯度上土壤微生物群落产生差异的主导因子。此外，植物群落对土壤特性有重要影响，从而改变土壤微生物的海拔分布[18]。因此，气候因素、土壤理化性质和植物群落均影响土壤微生物多样性和群落组成[19]。

目前，亚热带土壤微生物群落结构对海拔梯度响应的研究，主要针对细菌、真菌等大类的变化，而对不同分类水平下具体类群的关注相对较少。例如，在福建省戴云山自然保护区的研究表明：黄山松Pinus taiwanensis林土壤细菌/真菌比随海拔升高显著下降[16]；对武夷山主要植被类型土壤的研究表明：真菌数量随海拔升高而降低[20]。针对浙江凤阳山针阔混交林，孟苗婧等[17]利用磷脂脂肪酸法发现革兰氏阴性细菌丰度随海拔升高而增大，并且这种变化与土壤理化性质有关。这些大类群的变化并不能很好地表征土壤细菌和真菌在门水平乃至属水平的变化特征，因此，本研究通过高通量测序，探索凤阳山常绿阔叶林土壤微生物群落在不同海拔梯度下的变化规律，以增加对土壤微生物群落组成和多样性的了解。

1 研究区概况与研究方法

1.1 研究区概况

研究区位于浙江省丽水市龙泉市凤阳山自然保护区 (27°46′ ～27°58′N，119°06′ ～119°15′E)，面积约1.52万hm²，属中亚热带温暖湿润气候区。保护区年降水量为2 400 mm，年蒸发量为1 100 mm，年平均气温为12.3 ℃。主要天然植被为常绿阔叶林与针叶林，常绿阔叶林的优势属为木荷属Schima、润楠属Machilus、石栎属Lithocarpus、栲属Castanopsis、青冈属Cyclobalanopsis。土壤类型以红壤、黄壤为主，800 m以下为红壤，800 m以上为黄壤[17,21−22]。

1.2 土壤样品采集

选取4个不同海拔梯度下坡度、坡向、地上植被特征基本一致的常绿阔叶林地。海拔选择以土壤类型分界和凤阳山常绿阔叶林海拔分布范围为依据，分别为低海拔343 m (EG1)、中海拔765 m (EG2)、高海拔1 364 m (EG3)、高海拔1 611 m (EG4)。不同海拔的林分主要树种及郁闭度见表1。去除表面凋落物后，在每个海拔内设立10 m×10 m的样地3个，间隔10 m以上，在每个样地内沿对角线采集混合土壤样品，用于土壤理化性质的测定(表2)。考虑到土壤微生物异质性可能更强，在相同区域内按5 m×5 m，间隔10 m采集4个混合土样，−80 ℃冰箱保存，用于土壤微生物的高通量测序分析。由于本研究没有直接在研究地内监测温度，故采用凤阳山森林生态长期定位站设置的不同海拔梯度(241、600、900、1 364 m)温度监测数据进行拟合得到。年平均气温(y)随海拔(x)变化关系为y=−0.006 3x+21.592 (R2=0.994 2)。拟合得出4个海拔(EG1、EG2、EG3、EG4)的年平均气温分别为19.43、16.77、13.15、11.44 ℃。

表1 不同海拔林分特征Table 1 General Situation of the trees at different altitudes

表2 不同海拔土壤理化性质Table 2 Physical and chemical properties of soil at different altitudes

1.3 土壤理化性质测定

pH采用电位法(水土比为2.5∶1.0)通过pH计测定；土壤湿度采用环刀法测定；土壤总碳、全氮采用德国Element公司的元素分析仪测定(动态燃烧法)；土壤全磷采用酸溶-钼锑抗比色法，通过分光光度计测定；土壤全钾采用氢氧化钠熔融，火焰光度计测定[23]。

1.4 DNA提取与高通量测序

采用土壤DNA试剂盒(试剂盒名称为MagPure Soil DNA KF Kit)，从0.25 g土壤样品中提取DNA，利用琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000检测DNA浓度。以基因组DNA为模板，根据测序区域的选择，使用带 barcode 的特异引物，Takara公司的TksGflex DNA Polymerase进行聚合酶链式反应(PCR)。细菌16SrDNAV3-V4 扩增引物为 343F-5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′和 798R-5′- AGGGTATCTAATCCT-3′，真菌 ITS 扩增引物为 ITS1F-5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′和 ITS2-5′- GCTGCGTTCTTCATCGA TGC-3′。测序委托中国上海欧易生物医学科技有限公司Illumina MiSeq平台进行。将获得的原始序列用一系列软件Trimmonatic[24]、Flash[25]和QIIME中的split_libraries[26]处理，得到优化序列，并使用UCHIME软件[27]去除嵌合体；利用Vsearch软件[28]，生成操作分类单元(OTUs)，细菌、真菌相似度均为97%。

1.5 数据分析

首先，对所有数据进行正态分布检验和方差齐性检验，结果均符合正态分布。对于土壤理化性质和微生物多样性指数的数据，使用SPSS软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，确定不同海拔下土壤理化性质和土壤微生物多样性的差异(LSD最小显著差异法，显著性水平为P＜0.05)，其中土壤微生物覆盖度(goods_coverage，Cdepth)指数表示测序的深度。其计算方法为：Cdepth=1−n1/N，其中：n1为只含有1条序列的 OTU 数目；N为抽样中出现的总的序列数；对于门和属水平上各类群相对丰度的数据，利用Pearson相关分析来确定海拔与门和属水平上微生物群落的相关性；对于界、门、纲、目、科、属、种水平上土壤微生物相对丰度的数据，利用组间群落差异[LDA Effect Size(LefSe)]分析 (LefSe：http：//huttenhower.sph.harvard.edu/lefse/。设置标准：LDA大于2，P＜0.05)来研究不同海拔梯度下土壤微生物群落的差异类群[29]，对于OTU水平上土壤微生物序列数的数据，使用Canoco 5.0进行主坐标分析(PCoA)。由于微生物和土壤理化性质样品数量不一致，无法一一对应进行关联分析，故通过Bootstrap重采样方法，将每个海拔土壤微生物(n=4)与土壤理化性质(n=3)进行两两组合(12种可能)，从12种可能中随机抽取3个作为重复(n=3)，4个海拔共采集12个样品；重采样通过Matlab进行1 000次，每1次都计算土壤微生物与土壤理化性质的Pearson相关系数，得到相关系数的频率分布，最终计算得到平均相关系数。对照Pearson相关系数显著性检验表中0.05显著性水平下相关系数的临界值，采用双侧检验判断显著性。

2 结果与分析

2.1 不同海拔土壤微生物OTU数量

由图1A可知：细菌群落的OTU总数为8 408个，共享OTU数 2 828个。其中343、765、1 364、1 611 m特有OTU个数分别占到细菌OTU总数的7.67%、5.00%、6.24%、6.89%。两两比较中，中低海拔即343与765 m共有OTU数最多，为4 593个。海拔变化同样引起土壤真菌群落OTU数量变化。如图1B所示：检测出的真菌群落OTU总数少于细菌群落，为3 985个。不同海拔真菌群落共有的OTU占到真菌群落总数的4.19%。无论是细菌群落或真菌群落，中低海拔OTU数均高于高海拔；两两比较中，343与765 m共有的OTU数最多。这一结果表明343与765 m样地OTU组成相似。

图1 不同海拔土壤细菌(A)和真菌(B)群落维恩图Figure 1 Venn diagram showing the unique and shared OTUs at different elevations in bacterial (A) and fungal (B) communities

2.2 不同海拔常绿阔叶林土壤微生物多样性

Chao 1指数与Shannon指数分别反映了微生物群落的丰富度与多样性。细菌群落的多样性分析发现：中低海拔Chao 1指数显著高于高海拔1 364与1 611 m，呈现出沿海拔增高逐渐减小的趋势(P＜0.05)(表3)。Shannon指数在343 m处最高，显著高于765 m处(P＜0.05)。真菌群落的多样性结果显示：高海拔Chao 1指数显著低于中低海拔(P＜0.05)，Shannon指数在343 m处最低，且显著低于765与1 364 m处(P＜0.05)。细菌群落与真菌群落覆盖度指数均在0.97以上，且中低海拔呈现较低的水平(P＜0.05)，这说明测序结果可靠。

表3 不同海拔土壤微生物群落多样性Table 3 Soil bacterial diversity indices at different altitudes

2.3 不同海拔常绿阔叶林土壤微生物群落分布特征

2.3.1 土壤微生物门水平上的群落组成通过测序发现，4个海拔土壤细菌群落共检测出33个门。图2A为门水平上相对丰度前10位的细菌群落。分析显示：凤阳山常绿阔叶林优势菌群为酸杆菌门Acidobacteria、变形菌门Proteobacteria和放线菌门Actinobacteria。其中，酸杆菌门相对丰度高达43.77% ～51.55%，是丰度最高的类群，其次是变形菌门(31.18% ～35.77%)、放线菌门(5.24% ～7.99%)。Pearson相关性分析发现：芽单胞菌门Gemmatimonadetes、硝化螺旋菌门Nitrospirae、疣微菌门Verrucomicrobia与海拔呈极显著负相关(P＜0.01)，厚壁菌门Firmicutes与海拔呈显著正相关(P＜0.05)(表4)。

图2 不同海拔门水平上土壤细菌(A)和真菌(B)群落相对丰度Figure 2 Relative abundance of bacteria (A) and fungi (B) phylum at different altitudes

表4 海拔与微生物门Pearson相关性系数Table 4 Pearson correlation coefficient between altitude and soil bacterial phylum

图2B显示了所有鉴定出的已分类的门水平上的真菌群落。大部分类群隶属担子菌门Basidiomycota(33.16% ～67.35%)与子囊菌门Ascomycota (22.98% ～46.78%)。343 m处担子菌门最为丰富，相对丰度高达65.07%。子囊菌门是中高海拔相对丰度最高的真菌类群。除上述优势菌群，相对丰度高于1%的为343与1 611 m的接合菌门Zygomycota。

2.3.2 土壤微生物属水平上的群落组成细菌群落共检测出708个属。图3A展示了相对丰度前15位的细菌属，占21.61% ～24.52%。Candidatus_Solibacter相对丰度最高，在343、765、1 611 m 超过5%，Bryobacter在1 611 m最高，Acidibacter在各海拔相对丰度为2.25% ～3.01%。相关性分析(表5)显示：Acidibacter、Gemmatimonas、Sphingomonas、MND1与海拔呈显著负相关(P＜0.05)。

表5 海拔与微生物属Pearson相关性系数Table 5 Pearson correlation coefficient between altitude and soil bacterial genus

真菌群落共检测出384个属。图3B展示了相对丰度前15位的真菌属。红菇属Russula在343 m检出较多，相对丰度高达52.30%，中高海拔红菇属相对丰度均低于20%。Archeaorhizomyces相对丰度仅次于红菇属，在中高海拔大量存在。相关性分析(表5)显示：红菇属与海拔呈显著负相关，被孢霉属Morlierella与海拔呈显著正相关(P＜0.05)。

图3 不同海拔属水平上土壤细菌(A)和真菌(B)群落相对丰度Figure 3 Relative abundance of bacteria (A) and fungi (B) genus at different altitudes

2.4 土壤微生物LefSe分析

为进一步了解不同海拔土壤微生物组成的差异性，对不同分类水平上差异类群进行分析。除去未鉴定的物种，根据LefSe的结果显示：土壤细菌群落共有15个差异类群。其中1 364 m具有最多的差异类群，包括厚壁菌门、放线菌门、放线菌纲Actinobacteria、梭菌纲Clostridia、热酸菌属等类群。765 m处存在5个差异类群，包括细菌界Bacteria、Candidatus_Solibacter等类群。δ-变形菌纲Deltaproteobacteria是1 611 m的差异类群(图4A)。

图4 不同海拔土壤细菌(A)和真菌(B)群落LefSe分析Figure 4 LefSe analysis showing the significant differences at different bacteria (A) and fungi (B) taxonomic levels

土壤真菌群落共有23个差异类群。343 m处具有最少的差异类群，包括红菇目Russulales、红菇科Russulaceae、红菇属。765 m包括地舌菌纲Geoglossomyeetes、湿伞属、大团囊菌属等差异类群；1 364 m包括锤舌菌纲Leotiomyeetes、鹅膏菌属、Xerocomus、丝膜菌属等差异类群。1 611 m包括接合菌门、被孢霉属等差异类群(图4B)。

2.5 OTU水平上不同海拔微生物群落结构

采用主坐标分析(PCoA)法，基于杰卡德距离(binaryjaccard)算法，根据抽平后的OTU丰度分析不同海拔间微生物群落结构差异性，以二维图的形式呈现。由图5A显示：海拔引起了微生物群落的变化(P＜0.05)。在土壤细菌群落中，同一海拔高度内样本间的细菌群落组成相对接近。其次，中低海拔细菌群落高度相似位于第1主轴(PC1)的负轴上，高海拔细菌群落位于PC1正轴上。

图5 不同海拔OTU水平上土壤细菌(A)和真菌(B)群落PCoA分析Figure 5 PCoA analysis showing the first two principal coordinates at different altitudes in bacterial (A) and fungal (B) communities

对土壤真菌群落的PCoA分析中显示了与细菌群落基本一致的结果(图5B)，343与765 m各样本集中于PC1轴的负轴上，1 364与1 611 m各样本集中于PC1正轴上，343与765 m真菌群落相似度高，高海拔与中低海拔微生物多样性相似度低。

2.6 土壤理化性质对土壤微生物的影响

将土壤理化性质指标与微生物多样性、微生物群落结构[各样点在PC1、第2主轴(PC2)上的得分]进行Pearson相关性分析。结果(表6)表明：Chao 1指数与温度呈显著正相关(细菌的相关系数为0.886，真菌的相关系数为0.603，P＜0.05)。微生物群落结构的相关性分析发现，PC1轴与温度相关性最强(细菌的相关系数为−0.944，真菌的相关系数为−0.939)，呈显著负相关(P＜0.05)。同时，细菌、真菌群落的PC1轴也与土壤全磷、全钾、pH显著相关(P＜0.05)。

表6 土壤理化性质与土壤微生物的Pearson相关性分析Table 6 Pearson correlation between soil physical and chemical properties and soil microorganism

3 讨论

本研究通过高通量测序对浙江凤阳山不同海拔常绿阔叶林的细菌和真菌群落进行调查和分析，以探究海拔对土壤微生物分布的影响。α多样性分析结果显示：海拔343 m细菌群落具有较高的丰富度指数，随着海拔的上升，丰富度指数下降，高海拔地区细菌群落丰富度指数显著低于低海拔地区，但多样性指数在低海拔与高海拔间并无显著差异。细菌群落的丰富度受海拔形成的地理梯度影响较大。SHEN等[30]在研究长白山不同海拔冻原生态系统土壤细菌群落的多样性格局时发现：细菌群落丰富度随海拔上升线性下降，安前东等[31]在西藏的研究也得出了一致的结果。海拔与年平均气温和年降水量高度相关，因此土壤细菌群落受气候的影响大于受地球化学或土壤结构因素的影响[32]。尽管如此，也不能排除其他因素对细菌丰富度的影响，比如土壤碳氮含量、pH等土壤理化因子可能是造成这种差异性格局的主要因素[30−31]。本研究中，温度与丰富度指数相关性系数为0.886，是导致细菌群落丰富度沿海拔垂直分布的主要影响因子，而全磷、全钾也与细菌丰富度指数有一定的联系。此外，在部分研究中，并未发现细菌群落丰富度的垂直梯度模式。如贺婧等[33]发现：太白山与朱雀山北坡的土壤细菌群落Chao 1指数无明显规律。与细菌群落不同的是，真菌群落丰富度指数虽然存在沿海拔上升而下降的趋势，但只在1 611 m处显著下降，因此真菌群落丰富度指数与温度的相关性弱于细菌群落。目前，大部分研究集中于对土壤细菌群落的海拔格局研究，关于真菌群落的相关报道较少。WANG等[34]发现：土壤真菌丰富度与海拔呈显著负相关。李敏等[35]研究指出：真菌丰富度指数与多样性指数在海拔1 500 m时较低，但在海拔1 800 m时较高，表明海拔对真菌多样性格局的影响尚不明确。

除土壤微生物群落的多样性格局，本研究还关注群落中特定类群的变化。门水平上，细菌群落以酸杆菌门、变形菌门和放线菌门为主。这些类群在植物多糖物质降解过程中起到了关键性作用[36]。属水平上，凤阳山常绿阔叶林的优势属为Candidatus_Solibacter、Bryobacter、Acidibacter。其中，Candidatus_Solibacter与Bryobacter能够有效地利用碳源，与有机质相关[37]。在不同的分类水平上，不同海拔细菌群落相对丰度存在显著差异。LefSe分析显示：细菌群落在1 364 m具有最多的差异类群，343 m处不存在差异类群。细菌群落某一特定类群丰度并没有在343 m显著增加，但对于一些类群，如硝化螺旋菌门、Acidibacter等，与海拔呈显著负相关(P＜0.05)。这些个体类群与海拔之间的关系可能有助于整体细菌群落的海拔格局的形成[30]。真菌群落的优势菌群为担子菌门与子囊菌门。两者在刘子涵等[38]、薛晓敏等[39]的研究中也具有较高的丰度，是全球范围内最主要的土壤真菌门[14]。作为腐生菌，担子菌门和子囊菌门能够有效地分解植物残体[40]。根据LefSe的分析结果，虽然真菌群落比细菌群落具有更多差异类群，但是差异类群集中在分类水平较低的科、属上，且属水平上的相关性分析显示仅有2个属呈现垂直梯度的变化，因此真菌群落组成差异较大但具体类群沿海拔梯度垂直分布的特征不明显。

PCoA分析表明：无论是细菌群落还是真菌群落，海拔变化引起了土壤微生物群落组成的变化。343与765 m群落结构相似，且中低海拔与高海拔间存在明显分界，这与凤阳山土壤类型分界一致。厉桂香等[15]将其归结为微生物群落具有海拔分异性。本研究结果表明：343与765 m处具有更多共享的OTU数目，从另一角度佐证了微生物群落的海拔分异性特征。细菌和真菌群落结构在PC1轴上与温度相关性最强。由于海拔343 m处土壤理化性质与其他海拔差异较大，当去除343 m的数据进一步做相关性分析发现，PC1轴上，温度的影响并没有改变，但土壤理化性质与PC1轴的相关性明显减弱，土壤全磷、全钾、湿度、pH不再与PC1轴显著相关；PC2轴上，土壤理化性质的影响进一步增强，土壤全磷、全钾、湿度从弱相关变为显著相关(去除343 m后，细菌群落全磷、全钾、湿度与PC2轴相关系数绝对值均高于0.710，真菌群落绝对值均高于0.678)。这说明土壤微生物群落结构在PC1轴上主要受到温度的调控，而在PC2轴上由土壤理化性质起主导作用。在增温实验中，也同样验证了温度对微生物群落结构的重要性[41]。因此，温度是影响土壤微生物群落结构变化的主要因子，其次为土壤理化性质。