黄清晨，赖建新，黄李超，卢孟柱

（1. 浙江农林大学 林业与生物技术学院，浙江 杭州 311300；2. 浙江农林大学 省部共建亚热带森林培育国家重点实验室，浙江 杭州 311300）

土地盐碱化增大了土壤渗透压，导致植物吸水困难，对植物造成了生理干旱[1]。过多钠离子(Na+)、氯离子(Cl−)的积累，导致膜结构破坏，对植物造成渗透胁迫[2−3]。盐胁迫还导致植物内源活性氧(ROS)增加，引起细胞膜损伤甚至细胞死亡，抑制植株生长发育[4]。ROS作为响应盐胁迫的关键因子，在低水平下，诱导增强抗氧化酶活性，抵御盐胁迫；在高水平下，过量积累造成氧化胁迫，导致生物大分子产生不可逆的损伤，改变细胞形态结构，抑制植株生长发育[5]。为缓解ROS积累引起的氧化胁迫，植物通过增强抗氧化酶系统相关酶活性来降低体内的ROS，从而提高抗逆性[6]。植物的抗氧化酶系统主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化物酶(PRX)等[7]。

在小麦Triticum aestivum中过表达TaPRX-2A，植株抗氧化能力增强，ROS下降，耐盐性增加[8]。拟南芥Arabidopsis thaliana AtPRX19参与胁迫(盐害、干旱、病虫害等)后的氧化应激反应，使得ROS增加，对植物造成氧化胁迫。盐胁迫下，拟南芥AtPRX19表达量上调，ROS减少，抵御胁迫能力增强[9]。在胡萝卜Daucus carota中异源表达OsPRX114同样降低过氧化氢(H2O2)水平，提高植株的耐盐性[10]。玉米Zea mays的PRX家族成员ZmPRX26、ZmPRX42、ZmPRX71、ZmPRX75和ZmPRX78参与了对包括盐胁迫在内多种非生物胁迫的响应[11]。部分PRX家族成员通过协调水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)和乙烯(ET)等激素水平发挥作用[12]。

研究林木对盐胁迫的响应，揭示耐盐性相关机理，对培育耐盐性更强林木品种具有重要意义。为研究杨树PopulusPRX家族对林木耐盐性的影响，本研究以银腺杨‘84K’Populus alba × P. glandulosa‘84K’ (84K杨)为材料，通过构建PagPRX19的过表达转基因株系，改变杨树H2O2水平，并分析了杨树耐盐相关生理指标，以期揭示PagPRX19参与调控杨树盐胁迫响应的机制，为杨树的分子育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

研究材料为84K杨，过表达PagPRX19株系为本研究获得。

1.2 方法

1.2.1 生物信息学分析 Phytozome v13数据库中获取毛果杨Populus trichocarpa和拟南芥的PRX家族的蛋白序列、蛋白编码区(CDS)序列、启动子序列。利用P1ant CARE (http：//bioinformatics.psb.u-gent.be/webtooLs/pLantcare/html/)在线软件对PRX家族启动子顺式作用元件预测。使用MEGA v7软件，构建拟南芥和杨树的PRX家族的系统发育树，分析杨树和拟南芥PRX基因家族成员在进化关系上的同源性。利用MEGE v5.4.1 (https：//meme-suite.org/meme/tooLs/meme)在线软件分析PRX家族基因保守结构域。

1.2.2 基因表达模式分析 选用生长一致的84K杨树苗，分别从茎尖(SAM)、茎段3 ～10节间(IN3～IN10)、形成层(Ca)、幼叶(YL)、成熟叶(ML)、根(R)、木质部(Xy)取样，所有材料取3个生物学重复。采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)检测该基因在不同组织内的表达模式。

1.2.3 转基因苗获得 在84K杨基因组数据库中，通过Blast获取毛果杨PRX19同源基因PagPRX19，设计引物扩增获得目的基因(F端引物：ATGTATACAACAATCATGCCT，R端引物：TTATGTATG CATACTGCAAAC)，使用Gateway技术构建过表达载体35S：PagPRX19，利用叶盘转化法转化84K杨获得过表达PagPRX19转基因苗[13]。

1.2.4 盐胁迫处理 ①组培盐胁迫处理。以组培培养45 d的过表达株系为材料，以非转基因植株为对照。盐胁迫组接顶芽于100 mmol·L−1氯化钠(NaCl)生根培养基，对照组接顶芽于0 mmol·L−1NaCl生根培养基。每组处理12瓶，每瓶接2株顶芽。培养温度为23 ～25 ℃，光周期为8 h/16 h(黑暗/光照)。处理25 d，观察植株在长期盐胁迫下耐盐能力。②土培盐胁迫处理。以土培生长2个月的过表达株系为实验材料，以非转基因植株为对照，每组处理5株。盐胁迫组隔2 d浇灌1次100 mmol·L−1的NaCl溶液，对照组隔2 d浇灌1次0 mmol·L−1的NaCl溶液。培养温度为23 ～25 ℃，光周期为8 h/16 h(黑暗/光照)。处理7 d，取样测定各项生理指标，处理12 d后拍照[14]。

1.2.5 生理指标测定 ①脯氨酸质量分数测定。采用脯氨酸测试盒(南京建成，A107-1-1)测定脯氨酸质量分数。②相对含水量测定。取新鲜叶片记录鲜质量(WF)，超纯水(ddH2O)浸泡24 h记录质量(WT)，65 ℃烘箱干燥3 d，记录干质量(WD)。叶片相对含水量=(WF−WD)/(WT−WD)×100%[15]。③丙二醛(MDA)质量摩尔浓度测定。称取植物叶片0.2 g，加入4 mL质量浓度为10%的三氯乙酸(TCA)溶液和石英砂研磨至匀浆，4 000 r·min−1离心10 min，取上清液2 mL，加入2 mL硫代巴比妥酸(TAB)溶液，对照为2 mL ddH2O。摇匀后沸水浴15 min，−20 ℃迅速冷却后4 000 r·min−1离心2 min，取上清液，在532和600 nm 波长下测量吸光度。MDA 浓度CMDA(μmol·L−1)=[D(532)−D(600)]/155×1 000，MDA 质量摩尔浓度(nmol·g−1)=(CMDA×V提取液体积)/F样品质量[16]。④电解质渗透率测定。采用五点取样法取样，加入6 mL ddH2O，28 ℃摇床震荡1 h。取出测第1次电导值(G1)。沸水浴30 min，冷却至室温，摇匀测量第2次电导值(G2)。电解质渗透率=第1次电导值/第2次电导值×100%[17]。⑤ROS水平定性测量。DAB染色剂试剂盒(索莱宝，DA1010)染色检测H2O2；氯化硝基四氮唑蓝(NBT)粉末(索莱宝，N8140)染色检测超氧阴离子。

2 结果与分析

2.1 杨树PRX基因家族的生物信息学分析

使用拟南芥和毛果杨PRX家族的同源蛋白序列，构建系统发育树(图1)并进行保守结构域分析(图2)发现：该家族基因高度保守。对PRX基因家族启动子进行顺式作用元件分析(图3)发现：该基因家族成员含有响应生长素(IAA)、脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)等激素的功能元件以及响应低温、干旱、盐害等非生物胁迫的功能元件。因此，PRX家族为植物生长发育和参与抵御环境胁迫中的重要家族。毛果杨Potri.004G052100 (84K杨同源基因命名为PagPRX19)与拟南芥AtPRX19 (At2G34 060)的同源关系较近。研究表明：AtPRX19参与调控拟南芥的抗逆性[9,16]，推测与其同源的杨树基因PRX19也具有此功能。此外，PRX19启动子区域含有与盐胁迫密切相关的IAA、ABA和MeJA等激素相关顺式作用元件，参与植物耐盐调控。选取PagPRX19基因分析其在84K杨中的表达模式(图4)，结果显示：PagPRX19基因在各个组织均有表达，在木质部表达量最高。

图1 PRX基因家族系统发育树Figure 1 Phylogenetic analysis of the PRX gene family

图2 杨树PRX家族蛋白结构分析Figure 2 Protein motifs of the PRX family in poplar

图3 杨树PRX基因家族启动子顺式作用元件分析Figure 3 Cis-elements in promoters of PRX the gene family in poplar

图4 PagPRX19基因组织特异性表达Figure 4 Tissue-specific expression of PagPRX19

2.2 转基因苗的获取及表型分析

对转基因技术获得的6株植株进行阳性苗鉴定，通过RT-qPCR分析不同阳性株系PagPRX19的表达量，选取了相对表达量分别为对照46和12倍的2个株系OE#1、OE#2进行表型分析(图5)。分别选取6株生长2个月的土培苗统计株高和地径发现：株系OE#1的株高(44.15 cm)与对照(47.36 cm)相比极显著下降(P＜0.01)，而株系OE#2的株高(46.58 cm)与对照相比无显著差异。株系OE#1的地径(3.42 cm)和OE#2的地径(3.49 cm)与对照(3.22 cm)相比极显著增加(P＜0.01)。取植株第3片叶进行DAB和NBT化学染色(图6)发现：与对照相比，PagPRX19过表达植株叶片的ROS水平显著减少。对植株第7节间茎段组织切片进行DAB和NBT化学染色(图7)发现：与对照相比，过表达植株茎段的ROS水平降低，说明过表达PagPRX19导致植株ROS降低。

图5 阳性植株鉴定表型分析Figure 5 Identification and phenotypic analysis of transgenic overexpressed plants

图6 转基因植株第3片叶ROS水平检测Figure 6 Changes of ROS level in the third leaf of transgenic plants

图7 转基因植株第7节间茎段ROS水平变化Figure 7 Changes of ROS level in the stem of the seventh internode of transgenic plants

2.3 盐胁迫下植株相关生理指标的变化

在100 mmol·L−1NaCl生根培养基培养条件下(图8)，对照植株组培苗叶片大面积脱落，植株呈黄褐色，干枯严重甚至死亡。而过表达叶片失绿和皱缩情况与对照相比较轻，且无叶片脱落，说明过表达植株较对照具有更高的耐盐性。在100 mmol·L−1NaCl溶液灌溉处理下，对照植株叶片大面积脱落，皱缩明显，严重失绿。过表达株系OE#2叶片轻度失绿，叶缘处皱缩不明显。株系OE#1仅叶缘处轻微皱缩，与正常生长的处理差异不明显，与对照相比，过表达株系有更高的耐盐性，其中表达量较高的株系OE#1较OE#2耐盐性更强。

图8 盐胁迫下对照和转基因植株的表型特征Figure 8 Phenotypic characteristics of non- and transgenic poplars under salt stress

从图9可见：正常生长时，对照与过表达植株脯氨酸质量分数、相对含水量、丙二醛质量摩尔浓度、电解质渗透率无显著差异。盐胁迫下，相较于对照植株的脯氨酸质量分数(158.26 μg·g−1)，过表达植株脯氨酸质量分数极显著增加 (OE#1 为 244.94 μg·g−1，OE#2 为 217.02 μg·g−1)(P＜0.01)。与对照叶片相对含水量(70.05%)相比，过表达植株叶片相对含水量极显著高于对照(OE#1为82.68%，OE#2为80.25%)(P＜ 0.01)。与对照丙二醛质量摩尔浓度 (75.76 nmol·g−1)相比，过表达植株丙二醛质量摩尔浓度(OE#1 为 39.44 nmol·g−1，OE#2 为 50.76 nmol·g−1)较低且差异极显著(P＜0.01)。与对照电解质渗透率(32.75%)相比，过表达植株电解质渗透率(OE#1为24.24%，OE#2为27.09%)较低，且株系OE#1与对照差异极显著(P＜0.01)。

图9 盐胁迫下转基因植株的生理指标Figure 9 Physiological index of transgenic plants under salt stress

2.4 ROS水平定性测定

对盐胁迫处理后的土培苗叶片进行NBT和DAB染色(图10)发现：与对照相比，过表达植株叶片的ROS信号少。对盐胁迫处理后的组培苗根部进行DAB和NBT染色(图11)后发现：与对照相比，PagPRX19过表达植株根部的ROS信号少。说明在盐胁迫下，由于过表达PagPRX19导致植株ROS水平下降。

图10 盐胁迫下土培植株叶片ROS检测Figure 10 Detection of ROS in leaves of soil culture plants under salt stress

图11 盐胁迫下组培植株根部ROS检测Figure 11 Detection of ROS in roots of culture plants under salt stress

3 讨论

过氧化酶PRX可催化H2O2，降低ROS水平，减轻胁迫对细胞的伤害[3]。因此，通过抗氧化酶清除盐胁迫产生的ROS，以抵御胁迫带来的细胞损伤，提高林木的抗性，可作为抗逆分子育种手段。本研究通过过表达过氧化酶基因，改变84K杨内源ROS水平，从而探究ROS水平对杨树耐盐性的影响。

生物信息学分析发现：PagPRX19存在多个与IAA、ABA、或MeJA相关的顺式作用元件，这些激素与盐胁迫密切相关，参与植物耐盐调控。基因表达模式分析发现：PagPRX19在植株各个组织都有表达。因此选取该基因作为研究对象，创制过表达植株。与对照植株相比，过表达植株叶片和茎段ROS水平降低。过基因植株H2O2降低，也随之降低。可能是过表达加速了H2O2的清除，植物自身调控SOD酶加速分解产生H2O2，从而导致了减少[9]。对获得的转基因植株进行盐胁迫处理，在100 mmol·L−1NaCl处理下，对照植株出现了胁迫症状，但过表达植株症状轻或没有出现症状。过表达植株可能通过降低盐胁迫下植株氧化胁迫程度，增强耐盐性。ROS水平检测结果验证了这一推论，盐胁迫下，过表达植株与对照相比，ROS水平仍保持较低水平。表明过表达PagPRX19可降低盐胁迫下ROS的伤害，从而增强了转基因植株的抗性。

研究表明：盐胁迫下脯氨酸质量分数增加[17]，葡萄Vitis vinifera砧木在一定程度内的耐盐性越强，脯氨酸等有机渗透物质就越多[18]。本研究表明：盐胁迫下，过表达PagPRX19植株脯氨酸质量分数高于对照植株，使得植株的耐盐能力增强。此外，盐胁迫造成植物叶片含水量下降，植物生理活动会受到影响[19]。丙二醛和电解质渗透率反映了细胞膜损坏程度[20]。盐胁迫下，植株细胞膜被破坏，细胞膜内物质外渗，电解质渗透率升高，丙二醛增加[21−22]，而耐盐品种一般表现为叶片相对含水量高、电解质渗透率和丙二醛低的特点[19,23]。本研究中，盐胁迫下PagPRX19过表达植株叶片相对含水量比对照高，丙二醛、电解质渗透率降低，表明转基因植株细胞膜完整性较好，耐盐性增强。

4 结论

过表达过氧化物酶基因PagPRX19可降低84K杨植株内源ROS水平，且在盐胁迫下过表达植株ROS仍保持低水平，细胞膜的破坏程度降低、叶片的持水能力增强。表明在杨树中过表达PagPRX19，能促进盐胁迫下植株内源ROS的清除，从而减缓盐胁迫造成的氧化胁迫，提高植株的耐盐性。